DNA甲基化影响乙醛脱氢酶2（ALDH2）心肌缺血保护作用的基础研究

发布时间：2017-12-18 23:09

  本文关键词：DNA甲基化影响乙醛脱氢酶2（ALDH2）心肌缺血保护作用的基础研究

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【摘要】：乙醛脱氢酶2(ALDH2)是一种核编码酶,主要作用是在线粒体基质内催化能量代谢过程中生成的醛类产物氧化,并生成对应的有机酸。近几年研究已证实ALDH2在心肌细胞内高表达,而且ALDH2在包括心肌缺血在内的多种心肌损伤模型中均具有显著的心肌保护作用。心肌缺血时,ALDH2催化毒性醛类4-羟基壬烯醛(4-Hydroxynonenal,4-HNE)形成无毒的有机酸,从而阻断4-HNE 相关的活性氧(Reactive oxygen species, ROS)轴,减轻氧化应激反应,阻断下游由HSP70/JNK/p53介导的心肌细胞凋亡信号通路,最终发挥心肌缺血保护作用。另一方面,研究显示在心肌缺血过程中,心肌ALDH2含量降低,而给予外源性ALDH2补充会减少心肌缺血损伤。但是,如何解释“缺血心肌ALDH2表达降低”这一现象,研究者尚没有满意的研究证据。表观遗传学(Epigenetics)指的是：在不改变DNA碱基序列的前提下,进行的染色质层面的修饰及调节。调节方式包括组蛋白修饰、DNA甲基化及非编码RNA干预(如micro RNA)。其中DNA甲基化(DNA methylation)可以调控基因转录水平,其经典作用位点为DNA序列中的胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)形成CpG双核苷酸结构,该位点DNA在甲基化处理后,其中的C形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。一般来说,基因启动子区域高甲基化会降低其转录水平。而在心血管疾病领域,许多研究显示DNA甲基化可以影响先天性心脏病、心肌病及冠心病等多种心血管疾病。我们已往研究证实了心肌缺血后microRNA34a曾多,而且nicroRNA34a与ALDH2的mRNA特异性结合可降低ALDH2翻译水平。这一实验结果为解释心肌缺血过程中ALDH2减低提供了表观遗传学思路,但仅凭microRNA无法完全解释该现象。因此,继续探索影响ALDH2转录的相关机制或是解决这一问题的可行思路,而作为表观遗传学的重要组成部分,DNA甲基化恰可以调控基因转录。因此,我们提出假设：在心肌缺血过程中,缺血缺氧刺激导致了ALDH2启动子等基因调控序列的甲基化水平发生了变化,该DNA甲基化水平的变化进一步导致了ALDH2转录水平降低。为了解释这一问题,我们首先开展了有关ALDH2特异性低甲基化基因序列(LMR, low-methylated region)区域方法学研究,通过对比MassARRAY定量分析法与普通亚硫酸盐法(BSP, Bisulfite sequencing PCR)两者的检测效果,为ALDH2特点基因序列选择适宜的DNA甲基化检测方法(第一部分)。在优化DNA甲基化检测方法的基础上,我们进一步在Sprague Dawley大鼠上完成了心肌梗死模型以及后续药物干预实验。通过分析大鼠心梗边缘心肌组织的ALDH2蛋白表达、mRNA表达及启动子相关区域序列的甲基化水平,本研究拟探讨导致缺血心肌ALDH2表达降低的DNA甲基化机制,并寻找发生甲基化异常的基因序列,为临床心肌梗死诊疗提供新的思路及靶点(第二部分)。目的通过比较MassARRAY定量分析法与普通亚硫酸盐测序法(BSP)在大鼠ALDH2基因启动子甲基化检测效果,为确定适用于低甲基化基因序列检测的最佳方式提供依据。方法取10只体重为(200+10)g之间的雄性SD大鼠,分2组,每组5只,分为对照组与实验组。实验组行心脏冠脉左前降支结扎术,制备心肌梗死模型。常规饲养7天后同时取材,实验组取材部位为梗死边缘区心肌组织,对照组取材位置与实验组相同。提取边缘区心肌组织DNA。分别使用MassARRAY定量分析法与普通BSP法检测两组ALDH2基因核心启动子上游同一段DNA序列甲基化情况。结果BSP法可检测显示目标区域12个CpG位点,检测结果示对照组与实验组皆无DNA甲基化发生；MassARRAY定量分析法可检测目标区域10个CpG位点,结果提示该DNA序列在对照组及实验组均有有轻度DNA甲基化,且实验组5号、6号及7号CpG位点的甲基化水平与对照组存在统计学差异(P0.05)。结论对于低甲基化基因序列,MassARRAY定量分析法拥有更好的DNA甲基化检测精度,在定量分析DNA甲基化方面优于BSP法。ALDH2基因启动子相关序列中的部分特殊序列需采用MassARRAY检测方式。目的通过比较MassARRAY定量分析法与普通亚硫酸盐测序法(BSP)在大鼠ALDH2基因启动子甲基化检测效果,为确定适用于低甲基化基因序列检测的最佳方式提供依据。方法取10只体重为(200+10)g之间的雄性SD大鼠,分2组,每组5只,分为对照组与实验组。实验组行心脏冠脉左前降支结扎术,制备心肌梗死模型。常规饲养7天后同时取材,实验组取材部位为梗死边缘区心肌组织,对照组取材位置与实验组相同。提取边缘区心肌组织DNA。分别使用MassARRAY定量分析法与普通BSP法检测两组ALDH2基因核心启动子上游同一段DNA序列甲基化情况。结果BSP法可检测显示目标区域12个CpG位点,检测结果示对照组与实验组皆无DNA甲基化发生；MassARRAY定量分析法可检测目标区域10个CpG位点,结果提示该DNA序列在对照组及实验组均有有轻度DNA甲基化,且实验组5号、6号及7号CpG位点的甲基化水平与对照组存在统计学差异(P0.05)。结论对于低甲基化基因序列,MassARRAY定量分析法拥有更好的DNA甲基化检测精度,在定量分析DNA甲基化方面优于BSP法。ALDH2基因启动子相关序列中的部分特殊序列需采用MassARRAY检测方式。第一部分MassARRAY定量分析法与普通亚硫酸盐测序法检测乙醛脱氢酶2低甲基化基因序列效果的对比研究目的探索缺血缺氧条件下,心肌乙醛脱氢酶2(ALDH2)启动子甲基化水平的变化,并从DNA甲基化这一角度解释缺血心肌ALDH2水平降低。方法取40只体重为(200±10)g之间的雄性SD大鼠,分4组,每组10只,其中三组为心肌梗死模型组,造模方法为心脏冠脉左主干结扎术,剩余一组为空白对照组。心肌梗死模型三组根据术后取材时间分为心梗一周组、心梗二周组及心梗三周组。取材部位为心肌梗死边缘心肌组织,对照组仿心梗组位置取材。分别检测取材心肌的ALDH2蛋白表达、DNA甲基化相关调节酶、mRNA表达、心肌DNA甲基化总体水平及ALDH2启动子相关序列甲基化水平。另取10只雄性SD大鼠,注射地西他滨(DAC)干预体内DNA甲基化,每天以1mg/kg标准给药,一周后取材及检测方法同前。结果与正常心肌组织相比,缺血边缘区心肌ALDH2蛋白表达降低,mRNA表达降低(P0.05),但心肌DNA甲基化总体水平无显著差异。与正常心肌组织相比,缺血边缘区心肌ALDH2启动子核心区域甲基化水平无差异,两者均属于未甲基化区域,该结果为BSP检测所得。MassARRAY检测显示,缺血心肌ALDH2启动子上游494bp序列存在多个甲基化异常位点(CpGl, CpG2及CpG7),其甲基化水平显著高于正常心肌组织(P0.05)。给予DAC干预后该区域甲基化异常位点DNA甲基化水平降低,ALDH2蛋白表达及mRNA表达升高。结论心肌梗死造成缺血缺氧刺激导致ALDH2启动子上游序列发生DNA甲基化水平升高,该表观遗传学改变导致缺血心肌ALDH2转录及表达水平降低。DNA甲基化是调节缺血心肌ALDH2表达的重要机表观遗传学机制。目的探索缺血缺氧条件下,心肌乙醛脱氢酶2(ALDH2)启动子甲基化水平的变化,并从DNA甲基化这一角度解释缺血心肌ALDH2水平降低。方法取40只体重为(200±10)g之间的雄性SD大鼠,分4组,每组10只,其中三组为心肌梗死模型组,造模方法为心脏冠脉左主干结扎术,剩余一组为空白对照组。心肌梗死模型三组根据术后取材时间分为心梗一周组、心梗二周组及心梗三周组。取材部位为心肌梗死边缘心肌组织,对照组仿心梗组位置取材。分别检测取材心肌的ALDH2蛋白表达、DNA甲基化相关调节酶、mRNA表达、心肌DNA甲基化总体水平及ALDH2启动子相关序列甲基化水平。另取10只雄性SD大鼠,注射地西他滨(DAC)干预体内DNA甲基化,每天以1mg/kg标准给药,一周后取材及检测方法同前。结果与正常心肌组织相比,缺血边缘区心肌ALDH2蛋白表达降低,mRNA表达降低(P0.05),但心肌DNA甲基化总体水平无显著差异。与正常心肌组织相比,缺血边缘区心肌ALDH2启动子核心区域甲基化水平无差异,两者均属于未甲基化区域,该结果为BSP检测所得。MassARRAY检测显示,缺血心肌ALDH2启动子上游494bp序列存在多个甲基化异常位点(CpGl, CpG2及CpG7),其甲基化水平显著高于正常心肌组织(P0.05)。给予DAC干预后该区域甲基化异常位点DNA甲基化水平降低,ALDH2蛋白表达及mRNA表达升高。结论心肌梗死造成缺血缺氧刺激导致ALDH2启动子上游序列发生DNA甲基化水平升高,该表观遗传学改变导致缺血心肌ALDH2转录及表达水平降低。DNA甲基化是调节缺血心肌ALDH2表达的重要机表观遗传学机制。第二部分检测缺血大鼠心肌细胞乙醛脱氢酶2启动子甲基化水平变化的基础研究
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R54

【共引文献】

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本文编号：1305962