通心络保护内皮屏障减轻糖尿病心肌再灌注损伤的作用及机制研究

发布时间：2018-07-21 21:35

【摘要】：（一）通心络保护急性心肌梗死再灌注心肌损伤的机制：基于Sigmoid Emax数学模型的再分析目的：通心络(Tongxinluo, TXL)可模拟缺血预适应,发挥缩小急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)无再流面积和心肌缺血/再灌注后梗死范围的作用,初步机制为保护了心肌微血管内皮的结构和功能,然而其核心机制尚不清楚。本研究通过评价致死性缺血/再灌注损伤(ischemia reperfusion inj ury, IRI),即再灌注后坏死范围的严重程度,IRI(%)=坏死范围(%)-无再流范围(%),比较TXL对心肌微血管内皮结构-功能网络的影响,探索TXL减轻心肌IRI的关键指标。方法：本研究根据课题组以往19篇已发表文献的结果数据,将心肌无再流范围和梗死范围的关系建立数学模型。共纳入168只中华小型猪的实验数据进行了分析。通过比较缺血预适应(ischemia preconditioning, IPC)、后适应、TXL、缬沙坦、地尔硫卓、法舒地尔、瑞舒伐他汀、尼可地尔、辛伐他汀、卡维地洛、替罗非班、维拉帕米、腺苷共13种干预条件下IRI的程度,确定了缺血预适应组和钙拮抗剂组分别是IRI程度最轻和最重的两个组。用主成分分析的方法确定了缺血预适应发挥心肌保护的9个关键指标,即SUR2, iNOS活性,eNOS活性,VE-cadherin, β-catenin, γ-catenin, P-selectin,PKA活性以及eNOS表达。在这9个关键指标中,进一步分析确定了TXL发挥心肌保护的关键指标,并与他汀对比。结果：坏死范围和无再流范围符合Sigmoid Emax模型,坏死范围下降空间(NRS)与IRI的严重度呈正相关(R2=0.92,P0.01)；NRS与坏死范围呈正相关(R2=0.57,P0.01)。心肌微血管内皮功能性和结构性指标与NRS均成正相关(R2=0.64,R2=0.62,P均0.01)。TXL使SUR2. iNOS活性、eNOS活性、VE-cadherin、β-catenin、γ-catenin和P-selectin等指标均向假手术组方向恢复,并与他汀组相当(P均0.05)。另外,AMI/再灌注模型组增加PKA活性和eNOS表达,TXL可进一步增加PKA活性和eNOS表达,也与他汀组相当(P均0.05)。在以上九个指标中,TXL明显上调eNOS活性、eNOS、VE-cadherin、β-catenin、γ-catenin表达,与IPC组无差别(P均0.05),并与他汀组相当(P均0.05),与CCB组相比差异有统计学意义(P均0.05)。因此,这五个微血管内皮功能和结构指标可能是TXL减轻IRI的关键指标。结论：本研究提示致死性IRI是心肌坏死的重要原因之一。TXL预处理可通过模拟IPC改善心脏微血管内皮功能和可能与屏障相关的结构,减轻心肌IRI,且其效用与他汀类相当。（二）通心络通过保护内皮屏障功能减轻糖尿病心肌再灌注损伤的细胞实验研究：Angptl4的核心作用及机制目的：我们的系列研究发现,通心络能够防治AMI再灌注后的无再流面积,缩小梗死面积,机制与保护了心肌微血管内皮的结构和功能的完整性有关。然而,保护物质的有无及是什么并不清楚。针对这一问题,本课题组前期利用蛋白芯片技术发现,心脏微血管内皮细胞(HCMEC)在接受缺氧/复氧(H/R)处理后血管生成素样蛋白-4(Angptl4)的表达和分泌上调,而TXL可进一步增加Angptl4的表达和分泌水平。因此Angptl4可能是TXL防治心肌无再流并减轻心肌再灌注损伤的保护物质。另一方面,本课题组既往研究证实：TXL可显著改善心肌无再流和再灌注损伤,都是基于非疾病状态时,特别是内皮功能状态正常时,与临床转化医学还有距离。但在糖尿病时以及明确的内皮功能损伤的情况下,TXL是否仍具有保护AMI无再流的保护作用尚不清楚。肿瘤相关研究发现,Angptl4由内皮细胞分泌,可调控内皮屏障功能。PPARy激活可上调Angptl4的表达。研究也发现Angptl4也能保护缺血/再灌注损伤心肌,但是否也是通过保护了内皮屏障功能而实现尚不清楚。心肌组织中的PPARα表达丰富,能否调控Angptl4也不清楚。本研究旨在深入研究高糖和氧-糖-血清剥夺/复氧(OGSD/R)共同刺激下TXL对内皮屏障功能的影响是否通过Angptl4起作用,并与PPARα有关?以明确内皮细胞分泌的Angptl4在TXL保护内皮屏障中的核心作用和保护物质及其机制。方法：人心脏微血管内皮细胞在高糖(18mM)培养基中培养,将第5-6代细胞随机分为正常糖OGSD/R组、高糖OGSD/R组、胰岛素组Angptl4组1μg/ml)、TXL组Angptl4+阴性siRNA组、TXL+阴性siRNA组、Angptl4+Angptl4 siRNA组、TXL+Angptl4 siRNA组、Angptl4+MK886组(PPARα抑制剂,1μM)、TXL+MK886组、MK886组,共12组,每组6次重复。利用siRNA敲低内皮细胞Angptl4的表达,以证实内皮细胞是否通过Angptl4发挥保护作用。各组给予OGSD/R干预。荧光定量检测各组单层内皮通透性。共聚焦显微镜下观察内皮细胞骨架结构变化、观察黏附连接蛋白VE-cadherin定位和内化。ELISA法检测细胞上清中Angptl4的含量、胞核PPARα活性。Real time-PCR法检测Angptl4 mRNA表达。采用Western blot检测Angptl4表达,内皮屏障相关细胞间连接蛋白总integrin-α5、总β-integrin、总JAM-A、总Occludin、总p120-catenin、总VE-cadherin的表达。采用膜蛋白提取法提取内皮细胞膜蛋白,并采用Western blot测定细胞间连接蛋白膜integrin-α5、膜JAM-A、膜VE-cadherin的表达,以评价Angptl4、TXL和PPARα通路在高糖OGSD/R状态下对心肌微血管内皮屏障功能的作用和影响。结果：1.与正常单层内皮细胞相比,正常和高糖OGSD/R组内皮细胞通透性均显著增高(P均0.05),且高糖比正常糖组显著增高(P0.05)。与高糖OGSD/R组比较,胰岛素、Angptl4和TXL预处理组内皮通透性均显著降低(P均0.05),而且TXL与胰岛素及Angptl4的效果相当(P均0.05)。与Angptl4+Angptl4 siRNA组和TXL组比较,TXL+Angptl4 siRNA组内皮通透性均显著增高(P均0.05),说明敲低Angptl4的表达能阻断TXL的保护作用,TXL的保护作用依赖于HCMEC自身的Angptl4。与TXL组比较,TXL+MK886组内皮通透性显著增高(P0.05),提示PPARα通路抑制剂能阻断TXL的保护作用。2.测定内皮细胞Occludin、JAM-A、VE-cadherin、p120-catenin、integrin-α5、 integrin-β1表达,用于评价内皮细胞间连接结构的完整性。与正常糖OGSD/R组比较,高糖OGSD/R组JAM-A、VE-cadherin的表达均显著降低(P均0.05)。与高糖OGSD/R组比较,胰岛素和TXL预处理组JAM-A、VE-cadherin、integrin-a5表达均显著增高(P均0.05),而Angptl4组JAM-A、integrin-a5表达均显著增高P均0.05),且TXL与胰岛素及Angptl4对JAM-A表达的作用相当(P均0.05)。与Angptl4+Angptl4 siRNA组和TXL组比较,TXL+Angptl4 siRNA组JAM-A、VE-cadherin的表达均显著降低(P均0.05),说明敲低Angptl4的表达能阻断TXL的保护作用,TXL的保护作用依赖于HCMEC自身的Angptl4。与TXL组比较,TXL+MK886组JAM-A、VE-cadherin、integrin-α5、integrin-β1表达显著降低(P0.05),提示PPARα通路抑制剂能阻断TXL的保护作用。3.检测内皮细胞膜JAM-A、膜VE-cadherin和膜integrin-α5的表达可更好地反映屏障相关细胞间连接蛋白的功能。与正常糖OGSD/R组比较,高糖OGSD/R组三种内皮屏障相关膜蛋白表达均显著降低(P均0.05)。与高糖OGSD/R组比较,胰岛素、Angptl4和TXL预处理组膜VE-cadherin、膜integrin-α5的表达均显著增高(P均0.05),而且TXL与胰岛素及Angptl4对膜VE-cadherin和膜integrin-a5表达的作用相当(P均0.05)。与Angptl4+Angptl4 siRNA组和TXL组比较,TXL+Angptl4 siRNA组膜VE-cadherin和膜integrin-α5的表达均显著降低(P均0.05),说明敲低Angptl4的表达能阻断TXL的保护作用,TXL的保护作用依赖于HCMEC自身的Angptl4。与TXL组比较,TXL+MK886组膜integrin-α5的表达显著降低(P0.05),提示PPARa通路抑制剂能阻断TXL的保护作用。4.检测内皮细胞Anpglt4的表达。与正常糖OGSD/R组比较,高糖OGSD/R组Angptl4表达均显著降低(P均0.05)。与高糖OGSD/R组比较,胰岛素、Angptl4和TXL预处理组Angptl4表达均显著增高(P均0.05),而且TXL与胰岛素及Angptl4(P均0.05)。与Angptl4+Angptl4 siRNA组和TXL组比较,TXL+Angptl4 siRNA组Angptl4表达均显著降低(P均0.05),说明敲低Angptl4的表达能阻断TXL对Angptl4的上调。与TXL组比较,TXL+MK886组Angptl4表达显著降低(P0.05),提示PPARα通路抑制剂能阻断TXL对Angptl4的上调。5.测定内皮细胞PPARα活性,用于评价TXL的保护机制。与正常糖OGSD/R组比较,高糖OGSD/R组PPARa活性均显著降低(P均0.05)。与高糖OGSD/R组比较,胰岛素和TXL预处理组PPARα活性均显著增高(P均0.05),且TXL与胰岛素的效果相当(P0.05),而Angptl4组比胰岛素和TXL组均显著降低(P均0.05),说明Angptl4不能激活PPARα。与TXL组比较,TXL+Angptl4 siRNA组PPARα活性无显著改变(P0.05),提示敲低Angptl4的表达不能阻断TXL对PPARa的活化。与TXL组比较,TXL+MK886组PPARa活性显著降低(P0.05),提示PPARa通路抑制剂能阻断TXL对PPARa的活化。结论：1.正常糖和高糖OGSD/R均致心脏微血管内皮细胞的屏障功能损伤,且后者损伤更重。2.胰岛素、Angptl4和TXL均能保护高糖OGSD/R的内皮屏障功能,且TXL保护内皮屏障的效果不亚于胰岛素和Angptl4。3.TXL能够保护心肌微血管内皮通透性：Angptl4是其核心保护物质。4.TXL对内皮屏障的保护作用与其通过PPARα通路上调Angptl4有关。（三）通心络通过保护内皮屏障功能减轻糖尿病心肌再灌注损伤的动物实验研究：Angptl4的核心作用及机制目的：以动物实验方法进一步验证细胞实验的发现的结果,研究目的如下：1.探明非糖尿病非糖尿病瘦鼠、糖尿病鼠分别发生AMI再灌注后心肌梗死范围和再灌注损伤的程度,对心肌微血管内皮细胞(HCMEC)凋亡的影响以及对心肌微血管内皮屏障功能有无损伤。2.胰岛素、Angptl4和TXL能否保护糖尿病鼠AMI再灌注后心肌梗死范围和再灌注损伤、HCMEC凋亡及心肌微血管内皮屏障功能。3.Angptl4 siRNA敲低Angptl4的表达能否消除TXL对糖尿病鼠AMI再灌注后心肌梗死范围和再灌注损伤、HCMEC凋亡及心肌微血管内皮屏障功能的保护作用.4.PPARα是否参与调控TXL对糖尿病AMI再灌注后心肌梗死范围和再灌注损伤、HCMEC凋亡及内皮屏障功能的保护作用。方法：12周龄雄性ZDF大鼠104只,随机分为糖尿病鼠假手术组、糖尿病鼠MI对照组、非糖尿病非糖尿病瘦鼠MI组、胰岛素组(5U/100g体重)、TXL组(5mg/100g体重,AMI前1h给予单次负荷剂量)、Angptl4组(10μg/kg体重)、TXL+阴性siRNA组、Angptl4+阴性siRNA组、TXL+Angptl4 siRNA组、Angptl4+Angptl4 siRNA组、TXL+MK886组(PPARα通路抑制剂,0.4mg/kg体重)、Angptl4+MK886组和MK886组,共13组,每组8只。开胸结扎冠状动脉45 min,再开放180min,建立AMI再灌注模型。使用siRNA在体敲低Angptl4的表达。术中监测血流动力学变化；病理染色法测定心肌梗死面积(area of necrosis,AN);采用Miles法通过荧光定量测定心肌组织萃取液中异硫氰酸荧光素-右旋糖酐(FITC-dextran)的浓度；苏木素-伊红染色法评估心肌组织灶性出血程度；免疫组化法测定心肌组织髓过氧化物酶(MPO)和胞浆连环蛋白-p120(p120-catenin)表达；电镜观察心肌微血管内皮细胞超微结构；化学法测定随机血糖和血清肌酸激酶(creatine kinase,CK)活性；ELISA法测定血清心肌钙蛋白I(cTnI)水平和心肌组织PPARα活性；TUNEL测定心肌组织细胞凋亡,并结合内皮标记分子CD34双染法测定心肌微血管内皮细胞凋亡；蛋白印迹(Western blot)方法检测PPARα、Angptl4、血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)、整合素-α5(Interin-α5)和连接黏附分子(JAM-A)的表达,以评价Angptl4.TXL和PPARα通路在糖尿病鼠MI再灌注时对心脏微血管内皮屏障功能的作用和影响。结果：1.AMI再灌注期间大鼠的心脏血流动力学检测：在缺血前、缺血后45min及再灌注180min时,与糖尿病鼠假手术组相比,糖尿病鼠和非糖尿病瘦鼠MI对照组血流动力学参数LVEDP、dp/dtmax及dp/dtmin均显著恶化(P均0.05),且糖尿病鼠比非糖尿病瘦鼠组显著恶化(P均0.05)。与糖尿病鼠MI对照组比较,胰岛素组、Angptl4组及TXL组LVEDP、dp/dtmax及dp/dtmin均显著改善(P均0.05),且TXL与胰岛素及Angptl4的效果相当(P均0.05)。与Angptl4+Angptl4 siRNA组和TXL组比较,TXL+Angptl4 siRNA组LVEDP、dp/dtmax及dp/dtmin均显著恶化(P均0.05),说明敲低Angptl4的表达能阻断TXL的保护作用,TXL的保护作用依赖于内源性的Angptl4。与TXL组比较,TXL+MK886组LVEDP、dp/dtmax及dp/dtmin均显著恶化(P均0.05),提示PPARa通路抑制剂能阻断TXL的保护作用。2.检测心肌坏死区范围、CK活性、cTnI水平、心肌组织细胞凋亡以评估AMI再灌注后心肌损伤程度：与糖尿病鼠假手术组相比,糖尿病鼠和非糖尿病瘦鼠MI对照组心肌坏死区范围、CK活性、cTnI水平、心肌组织细胞凋亡均显著增加(P均0.05),且糖尿病鼠比非糖尿病瘦鼠组更高(P均0.05)。与糖尿病鼠MI对照组比较,胰岛素组、Angptl4组及TXL组心肌坏死区范围、CK活性、cTnI水平、心肌组织细胞凋亡均显著降低(P均0.05),且TXL与胰岛素及Angptl4的效果相当(P均0.05)。与Angptl4+Angptl4 siRNA组和TXL组比较,TXL+Angptl4 siRNA组心肌坏死区范围、CK活性、cTnI水平、心肌组织细胞凋亡均显著增加(P均0.05),说明敲低Angptl4的表达能阻断TXL的保护作用,TXL的保护作用依赖于内源性的Angptl4。与TXL组比较,TXL+MK886组心肌坏死区范围、CK活性、cTnI水平、心肌组织细胞凋亡均显著增加(P均0.05),提示PPARα通路抑制剂能阻断TXL的保护作用。3.危险区心肌微血管内皮细胞凋亡的检测：与糖尿病鼠假手术组相比,糖尿病鼠和非糖尿病瘦鼠MI对照组心肌微血管内皮细胞凋亡均显著增加(P均0.05),且糖尿病鼠比非糖尿病瘦鼠组显著增加(P均0.05)。与糖尿病鼠MI对照组比较,胰岛素组、Angptl4组及TXL组心肌微血管内皮细胞凋亡均显著降低(P均0.05),且TXL与胰岛素及Angptl4的效果相当(P均0.05)。与Angptl4+Angptl4 siRNA组和TXL组比较,TXL+Angptl4 siRNA组心肌微血管内皮细胞凋亡均显著增加(P均0.05),说明敲低Angptl4的表达能阻断TXL的保护作用,TXL的保护作用依赖于内源性的Angptl4。与TXL组比较,TXL+MK886组心肌微血管内皮细胞凋亡均显著增加(P均0.05),提示PPARa通路抑制剂能阻断TXL的保护作用。4.检测危险区心肌FITC-右旋糖酐含量、灶性出血、髓过氧化物酶(MPO)表达以评估心肌微血管内皮屏障功能。与糖尿病鼠假手术组相比,糖尿病鼠和非糖尿病瘦鼠MI对照组心肌FITC-右旋糖酐含量、灶性出血、MPO表达均显著增加(P均0.05),且糖尿病鼠比非糖尿病瘦鼠组显著增加(P均0.05)。与糖尿病鼠MI对照组比较,胰岛素组、Angptl4组及TXL组心肌FITC-右旋糖酐含量、灶性出血、MPO表达均显著降低(P均0.05),且TXL与胰岛素及Angptl4的效果相当(P均0.05)。与Angptl4+Angptl4 siRNA组和TXL组比较,TXL+Angptl4 siRNA组心肌FITC-右旋糖酐含量、灶性出血、MPO表达均显著增加(P均0.05),说明敲低Angptl4的表达能阻断TXL的保护作用,TXL的保护作用依赖于内源性的Angptl4。与TXL组比较,TXL+MK886组心肌FITC-右旋糖酐含量、灶性出血、MPO表达均显著增加(P均0.05),提示PPARa通路抑制剂能阻断TXL的保护作用。5.检测危险区心肌JAM-A、VE-cadherin、p120-catenin和Integrin-a5的表达以评估心肌内皮屏障结构完整性：与糖尿病鼠假手术组相比,糖尿病鼠和非糖尿病瘦鼠MI对照组心肌JAM-A、VE-cadherin和p120-catenin的表达均显著降低(P均0.05),且糖尿病鼠比非糖尿病瘦鼠组显著降低(P均0.05)。与糖尿病鼠MI对照组比较,胰岛素组、Angptl4组及TXL组心肌JAM-A、VE-cadherin、p120-catenin和Integrin-a5的表达均显著增加(P均0.05),且TXL与Angptl4对上述四种连接蛋白表达的作用相当(P均0.05),TXL与胰岛素对其中JAM-A、VE-cadherin、p120-catenin蛋白表达的作用相当(P均0.05)。与Angptl4+Angptl4 siRNA组和TXL组比较,TXL+Angptl4 siRNA组心肌JAM-A、VE-cadherin和p120-catenin的表达均显著降低(P均0.05),说明敲低Angptl4的表达能阻断TXL的保护作用,TXL的保护作用依赖于内源性的Angptl4。与TXL组比较,TXL+MK886组心肌JAM-A、VE-cadherin、p120-catenin和Integrin-a5的表达均显著降低(P均0.05),提示PPARa通路抑制剂能阻断TXL的保护作用。6.检测心肌Angptl4蛋白表达：与糖尿病鼠假手术组相比,糖尿病鼠和非糖尿病瘦鼠MI对照组心肌Angptl4蛋白表达均显著降低(P0.05),且糖尿病鼠比非糖尿病瘦鼠组显著降低(P均0.05)。与糖尿病鼠MI对照组比较,胰岛素组、Angptl4组及TXL组心肌Angptl4蛋白表达均显著增加(P均0.05),且TXL与胰岛素及Angptl4的效果相当(P均0.05)。与Angptl4+Angptl4 siRNA组和TXL组比较,TXL+Angptl4 siRNA组心肌Angptl4蛋白表达均显著降低(P均0.05),说明敲低Angptl4的表达能阻断TXL对Angptl4的上调。与TXL组比较,TXL+MK886组心肌Angptl4蛋白表达均显著降低(P均0.05),提示PPARα通路抑制剂能阻断TXL对Angptl4的上调。7.检测危险区心肌PPARα的活性以探明TXL的保护机制：与糖尿病鼠假手术组相比,糖尿病鼠和非糖尿病瘦鼠MI对照组心肌PPARα活性均显著降低(P均0.05),且糖尿病鼠比非糖尿病瘦鼠组显著降低(P0.05)。与糖尿病鼠MI对照组比较,胰岛素和TXL预处理组PPARα活性均显著增加(P均0.05),且TXL与胰岛素的效果相当(P0.05),而Angptl4组比胰岛素和TXL组均显著降低(P均0.05),说明Angptl4不能激活PPARα。与TXL组比较,TXL+Angptl4 siRNA组心肌PPARα活性无显著改变(P0.05),提示敲低Angptl4的表达不能阻断TXL对PPARa的活化。与TXL组比较,TXL+MK886组PPARα活性显著降低(P0.05),提示PPARα通路抑制剂能阻断TXL对PPARα的活化。结论：1.非糖尿病瘦鼠和糖尿病鼠MI再灌注后均致心肌再灌注损伤、心脏微血管内皮细胞凋亡及内皮屏障功能损伤,且糖尿病鼠损伤更重。2.胰岛素、Angptl4和TXL均能保护糖尿病鼠MI再灌注后的心肌再灌注损伤、心脏微血管内皮细胞凋亡及内皮屏障功能损伤,且TXL的保护效果不亚于胰岛素和Angptl4。3.TXL能够保护糖尿病鼠MI再灌注后的心肌再灌注损伤、心脏微血管内皮细胞凋亡及内皮屏障功能损伤；Angptl4是其核心保护物质。4.TXL对糖尿病再灌注心肌的保护作用与其通过PPARα通路上调Angptl4有关。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R542.22

【参考文献】