5-氮胞苷联合丹参酮ⅡA诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞定向分化的研究

发布时间：2018-12-19 17:24

【摘要】：由于当今社会人们生活水平的提高,饮食结构的变化,心血管系统疾病如缺血性心脏病,心肌梗死,扩张型心肌病,心脏衰竭等的发病也呈逐年上升趋势,威胁着人类健康。目前心肌梗死等疾病主要依靠溶栓、抗心力衰竭以及抗心律失常等治疗方法。对于扩张型心肌病的治疗则没有特效药物及方法,主要是针对心力衰竭等相关症状对症治疗。现有的研究也证实,中医药治疗心肌梗死等缺血性心脏病,在一定程度上缓解患者的临床症状且副作用小,但是单纯的中药治疗仍不能短时间内补充受损的心肌细胞,无法从根本达到治愈患者的目的。对于心血管系统疾病晚期的患者,心脏移植是唯一的有效治疗手段。因此研究者和临床工作者们仍努力寻找使已经坏死的心肌组织及细胞修复或再生的新的治疗方案,基于此,干细胞移植便成为了国内外心血管系统疾病研究的热点。骨髓间充质干细胞(Bone mensenchymal stem cells,BMSCs)是一种分化能力较强的细胞,且具有多向分化的潜能和较强的可塑性。在特定组织微环境作用下可以定向分化为相应组织所需的成熟细胞,如内皮细胞、神经肌细胞、肝细胞等,也能分化为心肌细胞。目前大多数研究者采用的使BMSCs定向分化为心肌细胞的诱导剂是5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)。临床上常用的治疗心血管疾病的中药作为诱导剂也逐渐成为人们关注的对象。丹参酮ⅡA(TanshinoneⅡA)是从中药丹参中提取的有效成分。研究表明,丹参酮ⅡA在诱导干细胞增殖和分化过程中显示出巨大的潜力。本研究探讨5-氮胞苷联合丹参酮ⅡA对BMSCs定向分化为心肌细胞的影响。首先分离并采集SD大鼠四肢骨骨髓,培养BMSCs,取第2代细胞生长48h后分为以下四组进行诱导:(1)加入含丹参酮ⅡA(终浓度为500ng/ml)的培养基,3天后去除诱导使用的培养基,加入不含有丹参酮ⅡA培养基继续培养4W。(2)加入含5-氮胞苷(终浓度为250μg/L)的培养基,3天以后去除诱导使用的培养基,加入不含有5-氮胞苷的培养基继续培养4W。(3)加入含丹参酮ⅡA和5-氮胞苷(终浓度分别为500ng/ml和250μg/L)的培养基,3天后去除诱导使用的培养基,加入不含有丹参酮ⅡA和5-氮胞苷的培养基继续培养4W。(4)对照组加入不含有诱导剂的培养基培养,3天以后换液。此后定期换液(1次/3天),每天观察细胞,当发现贴壁细胞融合达约90%的密度时用0.04%的EDTA和0.5%的胰酶(1:1)消化,随后以1:2的密度接种传代。应用免疫细胞化学技术检测结蛋白、横纹肌肌动蛋白(a-SCA-actin)和心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)的表达情况。免疫荧光双标染色技术检测联合诱导组a-SCA-actin、cTnT的表达。结果表明5-氮胞苷诱导组7d时细胞以梭形、多边形为主,丹参酮ⅡA诱导组培养10d时细胞逐渐呈长梭形,排列紧密,方向一致。二者联合诱导组加入诱导剂后28d的BMSCs呈长圆柱状,排列更加紧密,方向一致。未加诱导剂的BMSCs则呈纤维细胞样形态改变。免疫细胞化学观察在各诱导组cTnT、desmin、a-SCA-actin均为阳性表达,细胞质呈棕黄色,而对照组各标记物呈弱阳性或阴性表达,诱导各组与对照组各标记物的阳性表达均具有统计学差异(P0.05)。荧光免疫细胞化学染色结果显示,联合诱导组a-SCA-actin阳性表达为红色,cTnT阳性表达为绿色,两者重叠部位为黄色,呈现共表达。透射电镜结果显示,联合诱导组细胞可见平行排列的肌丝并富含线粒体、糖原和核糖体以及丰富的粗面内质网。结果显示:1.BMSCs可以通过TanshinoneⅡA单独诱导、5-aza单独诱导以及TanshinoneⅡA联合5-aza共同诱导等方式成功分化为心肌细胞。2.通过对各实验组分化细胞的desmin、α-actin、cTnT的表达情况以及形态学观察对比,观察到5-aza联合TanshinoneⅡA共同诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的阳性率明显高于5-aza和TanshinoneⅡA分别单独诱导分化的阳性率,5-aza和TanshinoneⅡA联合诱导的方式更加高效。
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【学位授予单位】：河北北方学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R54

【参考文献】