可溶性Corin的表达、纯化及功能研究

发布时间：2019-06-27 11:21

【摘要】：第一部分PCSK6对可溶性Corin活化作用的研究研究目的:Corin是一种从心脏中克隆出的Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶,其主要功能是将心房利钠肽前体(pro-atrial natriuretic peptide,pro-ANP)转化为有活性的心钠肽(ANP),从而发挥排钠利尿、舒张血管、降低血压和调节心脏功能的作用。在前期研究中,我们及其他课题组研究发现多个与高血压病发生相关的Corin基因突变及多态性,并证实这些基因变异影响Corin的功能。还发现心力衰竭患者血浆中可溶性Corin水平显著低于正常人,且降低程度与心衰严重程度相关。这些结果说明Corin缺乏或功能障碍可能会导致高血压及心衰等心血管疾病的发生。同时还有研究报道,在小鼠心衰模型研究中发现,过表达Corin能改善心功能,延长小鼠生存期。提示,补充外源性Corin,提高机体内Corin水平及活性,或许可作为治疗心衰的新方法。由于Corin是一个膜蛋白,不利于大量表达纯化,如能制备分泌型的可溶性Corin将解决这一难题。据报道缺失胞内段及跨膜区结构不影响Corin的表达及活性。这一发现也使我们研制有活性的可溶性Corin成为可能。同其他Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶一样,Corin是以酶原形式合成的,需要在其它蛋白酶的活化后才具有功能。因此,Corin的活化是其作为心血管蛋白酶发挥作用的关键环节。最近Chen等研究发现前蛋白转化酶枯草溶菌素6(Proprotein convertase subtilisin/kextin type 6,PCSK6)为Corin的活化酶。然而目前尚不清楚可溶性Corin能否被PCSK6剪切活化,从而使可溶性Corin具有活性。本部分研究中,我们将构建可溶性Corin和PCSK6的表达载体,转染细胞,表达可溶性Corin和PCSK6,并检测PCSK6对可溶性Corin的活化作用。研究方法:1.以野生型Corin质粒为模板,利用PCR方法、酶连等方法构建出可溶性Corin的表达载体“p SECsol Corin”及Corin突变体“R801A”和“S985A”。2.将野生型、可溶性Corin及突变Corin质粒转染入人胚胎肾(Human embryonic kidney,HEK)293细胞,收集培养上清,并制备细胞裂解液,蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测重组Corin蛋白在上清及胞浆内的表达。3.建立HEK293-PCSK6稳定表达细胞系,分别收集表达可溶性Corin及PCSK6的细胞上清,将可溶性Corin上清与不同体积的PCSK6上清孵育,Western blotting检测可溶性Corin的活化情况。4.收集pro-ANP上清液,将PCSK6活化的可溶性Corin上清以体积梯度加入pro-ANP上清中并孵育,用免疫共沉淀(Immunoprecipitation,IP)和Western blotting检测的pro-ANP活化情况,从细胞水平研究可溶性Corin的活化、表达及生物学功能。研究结果:1.我们构建了缺失胞内段及跨膜区的可溶性Corin表达载体。将野生型、可溶性Corin及突变体R801A和S985A分别转染HEK293细胞,Western blotting检测Corin蛋白在上清及胞浆内的表达。发现胞浆中Corin质粒均成功表达,在还原条件下,二硫键打开,在野生型Corin及蛋白酶活化位点突变体S985A可检测到~40 k Da的还原条带,而可溶性Corin和活化切割位点突变体R801A则未检测到还原条带。同时,检测到可溶性Corin在上清中的表达,相对分子量约150 k Da。提示我们成功构建可溶性Corin表达载体。2.我们向HEK293细胞转染PCSK6表达载体,进行筛选,1月后得到6株HEK293-PCSK6稳定表达细胞系。收集上清,与含可溶性Corin的上清共同孵育,Western blotting检测发现PCSK6可以切割可溶性Corin使其产生~40 k Da的活化条带,并呈现剂量依赖性。3.我们将已与PCSK6作用过的可溶性Corin加入到pro-ANP上清液中,发现可溶性Corin具有将pro-ANP活化为ANP的功能,并呈现剂量依赖性。结论:我们构建了可溶性Corin表达载体,DNA测序正确,并能在HEK293中表达。建立HEK293-PCSK6稳定表达细胞系。发现PCSK6可以活化可溶性Corin,活化后的可溶性Corin具有将pro-ANP转化为ANP的功能。本研究为我们进一步将可溶性Corin蛋白纯化并活化后用于心力衰竭的治疗打下重要的基础。第二部分重组可溶性EKCorin蛋白的表达、纯化及活性研究研究目的:Corin作为一种重要的心血管蛋白酶,具有排钠利尿、舒张血管、降低血压和调节心脏功能的作用。Corin的缺乏或功能障碍与高血压及心衰等心血管疾病的发生相关。鉴于目前顽固性心衰的治疗方法和效果均十分有限,因此研制具有生物学活性的可溶性Corin具有重大意义,有望开发成为新型的抗心衰药物,造福于广大心衰患者。第一部分我们研究证实可溶性Corin可以被PCSK6所活化,活化的Corin也具有生物学功能。但是,由于工具细胞HEK293细胞本身可表达内源性PCSK6,这将自发的活化部分Corin蛋白,催化其自身降解;另一方面,目前尚无商品化的PCSK6,PCSK6的表达纯化也是实验的瓶颈。因此为使制备大量的有活性的可溶性Corin蛋白成为可能,我们对可溶性Corin蛋白的结构进行改造,在其保守活化位点引入肠激酶(Enterokinase,EK)识别序列,可以用商品化的EK来活化重组蛋白,实现了对蛋白活性的特异性调控。为后期制备大量的具有稳定生物学活性的重组可溶性Corin奠定基础。研究方法:1.以EKCorin质粒(Corin切割活化位点第801位的精氨酸被肠激酶的活化位点取代)为模板,运用PCR、连接及转化等分子克隆技术构建带有EK识别序列的可溶性Corin表达载体p SECEKsol Corin。2.将p SECEKsol Corin质粒转染人胚胎肾293细胞,用潮霉素(50μg/m L)进行筛选,约1月后得到HEK293-EKsol Corin稳定表达细胞系,利用Western blotting检测可溶性Corin的表达及蛋白分子量大小,用ELISA方法检测可溶性Corin的表达量。3.收集HEK293-EKsol Corin稳定表达细胞的上清,经过镍柱亲和层析分离纯化收取目的蛋白,然后利用考马斯亮蓝染色及Western blotting初步鉴定蛋白纯度及分子量大小,BCA法测定蛋白浓度。4.用浓度梯度的EK活化重组蛋白EKsol Corin。5.通过pro-ANP活化实验检测纯化蛋白的生物学活性。研究结果:1.成功构建带有EK识别序列的可溶性Corin表达载体p SECEKsol Corin。2.获得150株EKsol Corin稳定细胞系,最终筛选出25株表达量大于0.1μg/m L的细胞株。3.镍柱亲和层析得到的纯化蛋白,纯度约为70%。4.EK作用后的EKsol Corin蛋白具有活化pro-ANP的功能。结论:我们构建了带有EK识别序列的可溶性Corin表达载体,DNA测序正确,并能在HEK293中表达,建立了高表达EKsol Corin的稳定细胞系。利用镍柱亲和层析纯化得到目的蛋白EKsol Corin,并用EK剪切活化,得到具有活性的可溶性Corin。本研究证实,可溶性Corin可在体外表达并被EK活化,活化后的Corin具有生物学活性,本研究为后期制备大量的有活性的可溶性Corin用于心衰模型小鼠的治疗奠定基础。
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【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R541.6

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