【摘要】：研究背景:冠状动脉粥样硬化性心脏病又称为冠心病(CHD),主要原因为冠状动脉血管发生动脉粥样硬化并且引起其血管腔狭窄或阻塞,继而造成心肌缺血、缺氧甚至坏死而导致的心血管疾病。急性心肌梗死(AMI)是一种危急的冠心病,为病人死亡的常见病因。脂质的异常代谢以及炎症在动脉粥样硬化与并发症(包括CHD和AMI)的发生和发展中起关键作用[1,2]。AMI是由环境和遗传因素交互作用共同导致的。目前全基因组研究已经鉴定出了大量与CHD和AMI相关的基因位点,但是这些基因位点只能解释10%的病例[3-5]。自噬为溶酶体介导的蛋白质与细胞器官降解的高度保守的机制,其在维持细胞内环境稳态中起关键作用。研究发现自噬对缺血心肌存在保护性作用,同时自噬可以抑制心肌重构,从而减少心肌组织坏死面积[6]。自噬能清除受损蛋白以及细胞器等,对保证细胞内环境稳态至关重要,但是自噬过度可能会降解细胞生存所需重要的蛋白或细胞器。转录因子TFEB为螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链bHLH-LZ类转录因子,同TFEC,TFE3,及MITF均属MiTF/TFE家族[7,8]。TFEB在基本细胞过程调节中起关键作用,例如溶酶体生物发生和自噬[9]。TFEB基因的过度表达显著增加自噬体的产生以及溶酶体相关蛋白的表达[10]。因此,我们通过研究AMI患者和健康人群中TFEB基因启动子区域序列变异,进而给AMI的治疗提供遗传学方面的支持。研究目的:通过测序,在急性心肌梗死患者和健康对照中发现TFEB基因启动子低频率遗传突变和单核苷酸多态性,构建TFEB基因启动子突变位点的pGL3-basic报告基因载体,研究TFEB基因启动子区域的序列变异以及功能变异对急性心肌梗死发展的影响。研究方法:1、应用大样本病例对照的方法,纳入急性心肌梗死病人352例,同期进行查体的健康对照病人337例,分别收集两组人群的临床资料。从纳入样本的外周血白细胞中提取全基因组DNA。2、通过NCBI基因数据库,查找分析TFEB基因启动子区域序列,进行引物合成,使用PCR反应对靶基因片段进行扩增,并通过测序发现突变位点。将TFEB基因启动子野生型靶片段和序列突变位点分别构建到PGL3-basic报告载体中。然后通过脂质体包裹将构建成功的pGL3报告基因载体连同内参质粒pRL-TK 一起瞬时转染到HEK-293和H9C2细胞中,收集细胞好裂解液并通过双荧光报告基因分析仪进行分析,通过双荧光素报告基因检测试剂盒检测转染细胞内萤火虫荧光素酶同海肾荧光素酶的活性,探索TFEB基因启动子区域变异对其转录活性的影响。3、我们使用TRANSFAC program分析TFEB基因启动子区域低频变异是否影响某些假定转录因子结合,对比正常序列结合的转录因子以及突变处结合的转录因子的改变。4、采用生物素标记的TFEB基因启动子正常寡核苷酸序列和突变序列的探针,通过EMSA实验分析基因序列的变异对与其结合的转录因子的影响。研究结果:1、实验组与对照组中测序共发现15个DNA序列变异(DSVs)位点,在AMI组发现2个新的DSVs和4个SNPs,分别为DSVs(g.41737144 AG、g.41736544CT)和4个SNPs[g.41737274TC(rs533895008)、g.41736987CT(rs76029 3138)、g.41736806CT(rs748537297)、g.41736635TC(rs975050638)]。在对照组中同样发现4个新的DSVs和2个SNPs,分别为DSVs(g.41737451TG、g.41736981AG、g.41736407CT、g.41736218TG)和2个SNPs[g.41737034CA(rs73733015)、g.41737005GA(rs14916635 8)]。AMI组与对照组中均发现两个DSVs和2个SNP,分别为DSVs(g.41737034GA、g.41736740CA)和 1个SNP[g.41737 034GC(rs7373 3015)],均无统计学意义(P0.5)。2、将变异位点构建pGL3-basic报告基因载体,如下为pGL3-WT(wild-type TFEB基因启动子)、pGL3-41737451G、pGL3-41737274C、pGL3-41737144G、pGL3-41737034C、pGL3-41737034A、pGL3-41737005A、pGL3-41736987T、pGL3-41736981G、pGL3-41736806T、pGL3-41736635、pGL3-41736544T、pGL3-.41736407T和pGL3-41736218G。3、构建pGL3-basic报告基因载体,将构建好的报告基因载体与pRL-TK内参质粒体外共转染到HEK-293细胞系和H9C2细胞系,检测不同DSVs和SNPs的相对荧光素酶活性。(1)转染HEK-293我们检测到,AMI组内的6个DSVs和SNPs均能明显改变TFEB基因启动子的转录活性,其中SNP[g.41736987CT(rs760293138)]显著减低了TFEB基因启动子的转录活性(P0.01),而DSVs[g.41737144 AG,g.41736544CT]以及SNPs[g.41737274TC(rs533895008),g.41736987CT(rs760 293138),g.41736806CT(rs748537297),g.41736635TC(rs9750506380)]显著增加了TFEB基因启动子的转录活性(P0.01)。在对照组中发现的4个DSVs[g.41 737451TG,g.41736981AG,g.41736 407CT,g.41736218TG]和2个SNPs[g.41737005GA(rs149166358),g.41737034CA(rs73733015)]以及实验组和对照组中均存在的SNP[g.41737034GC(rs73733015)]均未对TFEB基因启动子的转录活性造成影响(P0.05)。(2)转染H9C2细胞,我们发现结果与HEK-293细胞中结果一致,存在于AMI组内6个DSVs和SNPs显著改变了TFEB基因启动子的转录活性,其中SNP[41736987CT(rs760293138)]减低了TFEB基因启动子的转录活性(P0.05),而DSVs[g.41737144 AG,g.41736544CT]以及SNPs[g.41737274TC(rs533895 008),g.41736987CT(rs7 60293138),g.41736806CT(rs748537297),g.41736635 TC(rs9750506380)]增加了TFEB基因启动子的转录活性(P0.05)。在对照组中发现的4个DSVs[g.41737451TG,g.41 736981AG,g.41736407CT,g.417 36218TG]和2个SNPs[g.41737005GA(rs14916 6358),g.41737034CA(rs7373 3015)]以及实验组和对照组中均存在的SNP[g.41737034 GC(rs73733015)]均未能对TFEB基因启动子的转录活性造成影响(P0.05)。4、推测TFEB基因启动子DSVs影响转录因子结合,通过TRANSFAC program分析TFEB基因启动子序列结合的转录因子,推测SNP[g.41737274TC(rs533895008)]可能消除了转录因子HMGA factors和NF-Y的结合位点,增加了转录因子NR-DR、TGF-7和BRCA1的结合位点。DSV[g.41737144AG]可能修饰了转录因子 BRCA1 和 SREBP factors 结合位点。SNP[g.41736987CT(rs76029313 8)]可能修饰了转录因子CBF-1/RBP-J的结合位点。SNP[g.41736806CT(rs748537297)]可能增加了转录因子PPARGAMMA的结合位点。SNP[g.41736635TC(rs975050638)]消除了转录因子GFI1 factor的结合位点,增加了转录因子GR-like receptors的结合位点。DSV(g.41736544CT)可能修饰了转录因子SREBP和GR-like receptors结合位点。5、凝胶迁移实验(EMSA)结果显示SNP[g.41737274TC(rs533895008)]改变了原有转录因子的结合,出现了新的转录因子。DSV(g.41737144AG)、SNP[g.41736987CT(rs760293138)]和DSV(g.41736544CT)增强了原有转录因子的结合。而SNP[g.41736806CT(rs74853729)]和SNP[g.41736635TC(rs975050638)]没有影响转录因子的结合。因此,我们推测上述DSVs和SNPs可能通过改变或者影响某些转录因子的结合进而导致TFEB基因启动子的转录活性发生变化。研究结论:在本研究中,对TFEB基因启动子进行遗传和功能分析。在AMI患者中鉴定出两个DSVs和四个SNPs,其显著改变了 TFEB基因启动子的转录活性。此外,两个DSVs和两个SNPs明显影响相关转录因子的结合。因此,这些DSVs和SNPs可能会改变TFEB基因表达水平,作为低频风险因素促进AMI的发展。
【图文】：
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R542.22
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