MicroRNA-214-3p通过抑制细胞自噬促进动脉粥样硬化内皮细胞损伤的机制研究

发布时间：2020-03-24 04:41

【摘要】：目的:血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VECs)损伤在动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的发病机制中起着重要作用,而VECs自噬水平的适度调节可以减轻细胞损伤,对AS的发展具有保护作用,但其调节机制还未被阐明。MicroRNAs是一类新发现的表观遗传调控因子,通过特异性下调靶基因的转录后表达参与调控细胞的增殖、分化和凋亡等多种生物学过程。冠心病患者外周血microRNA-214-3p(miR-214-3p)水平已被报道与病情严重程度相关,但内皮特异性表达的miR-214-3p在AS中的作用还没有研究。本研究旨在探讨miR-214-3p是否参与AS斑块内皮细胞的自噬调节并阐明其机制,以期为AS的治疗提供新的干预靶点。方法:一)体内实验:使用高脂喂养ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠12周作为AS模型;利用流式细胞仪分选出CD31+的主动脉弓段VECs后,我们检测了细胞中miR-214-3p的表达水平和自噬相关基因(autophagy-related genes,ATGs)的蛋白表达水平,并分析了miR-214-3p与ATG5和ATG12蛋白水平的相关性;进行生物信息学分析和双荧光素酶报告基因测定确认miR-214-3p的靶基因;二)体外实验:用100μg/mL 氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)刺激人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)12h,然后转染miR-214-3p模拟物/抑制剂,采用western blotting检测自噬相关蛋白表达水平;采用透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)观测胞质内自噬体数目变化;免疫荧光检测胞质内蛋白微管相关蛋白1轻链3B-Ⅱ(protein microtubule-associated protein 1 light chain 3B-Ⅱ,LC3B-Ⅱ)的表达量及分布;油红O染色检测胞质内脂质积累情况;检测细胞对THP-1单核细胞的粘附能力;CCK-8检测细胞活力,TUNNEL实验检测细胞凋亡,同时检测caspase-3/cleaved caspase-3蛋白水平。结果:在AS小鼠模型中,我们发现血管损伤处VECs中miR-214-3p表达水平显著上调,伴随自噬相关蛋白水平明显下调;相关性分析显示miR-214-3p与ATG5和ATG12蛋白水平呈负相关(R=0.461,p=0.003;R=0.412,p=0.013);在体外实验中,我们观察到ox-LDL可以诱导群体倍增数(Population Doublings,PDL)为5的年轻HUVECs的自噬,同时miR-214-3p水平降低;过表达miR-214-3p可以抑制ox-LDL诱发的自噬,表现为ATG5、ATG12-ATG5、ATG12和LC3B-Ⅱ蛋白水平下降,SQSTM1/P62蛋白水平升高,胞质内LC3B-Ⅱ荧光强度减弱及自噬体数目减少;过表达miR-214-3p可以降低PDL5 HUVEC的细胞活力,并增加细胞凋亡;此外,miR-214-3p还能促进胞质中脂质积聚和THP-1细胞粘附;相反,在PDL36的衰老HUVECs中,ox-LDL刺激后表现为细胞自噬被抑制,同时miR-214-3p水平升高;低表达miR-214-3p可以恢复ox-LDL抑制的自噬,增加细胞活力,减少细胞凋亡,同时胞质中脂质积累和THP-1细胞粘附均减少。结论:在小鼠AS模型中,血管损伤处miR-214-3p水平显著上升,其水平与自噬蛋白ATG5和ATG12水平负相关;体外实验中,miR-214-3p可以通过抑制HUVECs中ox-LDL刺激的自噬水平,从而损伤内皮细胞功能,其作用可能是通过直接靶向作用于ATG5实现的,该调节途径可能为治疗AS中内皮细胞的损伤提供新的靶点。
【图文】：

４．１．１动脉粥样硬化小鼠模型的建立逡逑喂养１２周后，动脉粥样硬化（ＡＳ）小鼠的平均体重明显高于对照组（ＣＴＬ）逡逑小鼠（图４．１Ａ）；邋ＡＳ组血清血脂四项指标ＴＧ、ＴＣ、ＨＤＬ－Ｃ和ＬＤＬ－Ｃ水平分别为逡逑（２．２５±０．６０）ｍｍｏｌ／Ｌ、（２７．３２±５．１３）ｍｍｏｌ／Ｌ、（２．３８±０．３２）ｍｍｏｌ／Ｌ邋和（２０．１２±４．０２）逡逑ｍｍｏｌ／Ｌ，ＣＴＬ组血清血脂四项指标ＴＧ、ＴＣ、ＨＤＬ－Ｃ和ＬＤＬ－Ｃ水平分别为（Ｌ０８±０．２１）逡逑ｍｍｏｌ／Ｌ、（５．１０±１．１２）邋ｍｍｏｌ／Ｌ、（４．２９±０．４５）邋ｍｍｏＩ／Ｌ邋和（０．８１邋士０．１６）邋ｍｍｏｌ／Ｌ；邋ＡＳ逡逑组ＴＧ、ＴＣ和ＬＤＬ－Ｃ水平明显高于ＣＴＬ组，差异有统计学意义（ｐ＜０．０５）；邋ＡＳ组逡逑血清ＨＤＬ－Ｃ水平明显低于ＣＴＬ组，差异有统计学意义（ｐ＜０．０５）（图４．１Ｂ）；光镜逡逑下，ＡＳ小鼠主动脉弓段血管可见明显的黄白色脂质斑块形成，管腔形状狭窄、不逡逑规则，ＣＴＬ小鼠主动脉弓段血管未见脂质沉积，管腔光滑、通畅（图４．１Ｃ）；主动逡逑脉弓段血管石蜡切片ＨＥ染色可见，ＡＳ小鼠血管腔内有明显脂质斑块内凸生长，逡逑造成管腔面积比ＣＴＬ小鼠明显减少（图４．１Ｄ），，量化分析血管损伤区域管腔横截面逡逑面积发现

胞（ＶＥＣｓ邋）后，我们用ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ方法检测两组小鼠ＶＥＣｓ中自喔相关基因逡逑的蛋白表达水平差异。我们发现与ＣＴＬ俎相比，ＡＳ组ＶＥＣｓ中自噬相关基因ＡＴＧ５、逡逑ＡＴＧ１２和ＡＴＧ１２－ＡＴＧ５复合物的蛋白表达水平均明显降低（图４．２Ａ－Ｂ）邋（ｐ＜０．０５）；逡逑ＬＣ３Ｂ－Ｉ和ＬＣ３Ｂ－ＩＩ的蛋白表达水平明显降低（图４．２Ａ－Ｂ）（尸＜０．０５）；以上结果均逡逑提示ＡＳ组小鼠ＶＥＣｓ的自噬水平受到抑制；两组小鼠ＶＥＣｓ中ｂｅｃｌｉｎ－１的蛋白表逡逑达水平无明显差异（图４．２Ａ－Ｂ）邋（ｐ＞０．０５邋）；与ＣＴＬ组相比，ＡＳ组ＶＥＣｓ中逡逑ＳＱＳＴＭｌ／ｐ６２的蛋白表达水平明显升高（图４．２Ａ－Ｂ）（尸＜０．０５），ＳＱＳＴＭｌ／ｐ６２的蛋白逡逑降解减少，ＳＱＳＴＭｌ／ｐ６２是反映自噬流的较好指标，说明ＡＳ组小鼠ＶＥＣｓ中自噬逡逑流减弱。以上结果提示，相比于ＣＴＬ组小鼠，ＡＳ姐小鼠ＶＥＣｓ中存在明显的自噬逡逑水平抑制，且自噬流减少。逡逑Ａ逦邋Ｂ逦□ＣＴＬ逡逑■邋ＬＯＢＩ逦ｃ逦□邋ＡＳ逡逑■■■邋＃ｌｉＭＣ邋ＬＣ３Ｂ－ＩＩ逦．２逦２邋５７逦７逡逑－Ｉ逦ｇ逦ｔ逡逑ｒｎｒｎｍｍｍ邋ｂｅｃｌｉｍ逦Ｉ逦２邋0－逦—＂１逡逑二逦■■■■■｛逦ｗ邋１５．逦邋－逡逑ＡＴＧ５逡逑■■■＝逦＝＝｛逦￡邋ｉ邋１１！逦ｒＳ邋Ａ．邋ｔＶ邋ｒＶ邋ｒＶ逡逑逦＾｜ＡＴＣ．２－ＡＴＣＳ逦－逦十？逦ｉ邋ｉ邋卞逡逑ＪＬ邋Ｉ邋Ｊｌ邋＇逡逑■丨．丨■■＂逦１逦ＱＣ邋０邋０邋、一＾邋＾邋＊邋．１＾邋ＩｊＵ邋Ｙ－Ｊ一—邋Ｙ－Ｂ逡逑？

本文编号：2597813