炎症消退和神经重建在小口径组织工程血管长期通畅中的作用研究

发布时间：2020-03-30 23:10

【摘要】：心血管疾病是威胁人类健康的第一大疾病,全球每年有730万人死于缺血性心脏病,列各病之首。冠状动脉旁路移植术、血液透析或外周血管闭塞治疗等使小口径TEBV(TEBVs6mm)的临床需求日益增大。但目前还未见小口径TEBV应用于临床产品的报道,究其原因主要是因为小口径TEBV移植后容易发生5方面问题:急性血栓形成、吻合口内膜增生、动脉瘤形成、感染、动脉粥样硬化进展和钙化;因此构建保持长期通畅小口径TEBV仍是领域内难题和全球性挑战。小口径TEBV在植入体内后引发的急慢性炎症反应是引起小口径TEBV血栓和内膜增生的重要诱因,目前公认的解决办法是促进TEBV的早期内皮化。内皮祖细胞(EPCs)作为促进TEBV实现在体内皮化的靶细胞,诱导其归巢并分化为内皮细胞是小口径TEBV在体构建的策略。研究表明急性炎症反应可以促进组织再生发生和骨髓EPC的动员,而炎症的及时消退对归巢干细胞的存活又十分必要,因此及时促进炎症消退对TEBV在体内皮化和保持长期通畅可能有重要作用。有研究发现神经轴突导向因子1(netrin-1)在天然血管的内皮细胞中有表达,其可作用于UNC5B和DCC受体促进血管生成,并具有抗炎作用。本研究采用层层自组装的方式构建壳聚糖纳米颗粒包裹netrin-1修饰的小口径TEBV,通过大量体内和体外实验研究其在调控巨噬细胞(MΦ)表型转化和小口径TEBV炎症消退及内皮化中的作用和机制。本研究构建的netrin-1修饰小口径TEBV植入后及时促炎症消退并顺利完成内皮化,最终在正常大鼠体内可保持14个月的通畅。但是在植入糖尿病大鼠后,由于机体脂质代谢紊乱,动脉粥样硬化易发,TEBV发生钙化的比例却极高,直接影响移植血管的通畅和功能。小口径TEBV移植是治疗糖尿病中小血管病变的重要手段,因此,如何在高糖下防止TEBV钙化、促进远期通畅,是TEBV移植治疗糖尿病血管病变需解决的关键问题。自体环境中人体除毛细血管外几乎所有血管都受交感缩血管纤维的神经支配,我们前期研究发现TEBV神经长入与平滑肌正常重建呈正相关,但其机制尚不清楚,所以深入研究神经重建对于小口径TEBV的作用具有重要意义。因此,围绕上述科学问题,我们从四个方面深入研究炎症消退和神经重建在构建抗血栓和抗高糖钙化的可保持长期通畅的TEBV中的重要作用:一、netrin-1调控小口径TEBV炎症消退及其机制研究本实验通过层层自主装方式将netrin-1包裹于壳聚糖纳米颗粒中并交联于TEBV表面,使TEBV具有良好的力学强度和长时间稳定缓释功能分子的能力以解决炎症和血栓形成问题。在体外通过流式、免疫荧光等方式检测了netrin-1对MΦ表型转化的作用,并进一步检测其上清炎症因子来验证转化效率,体内通过免疫荧光方式检测TEBV原位MΦ的浸润以及netrin-1对于炎症消退的作用。结果发现netrin-1可作用于A2b受体激活MΦ内PPARγ信号通路从而将其重编程为强表达CD163的抗炎型。在将netrin-1修饰的TEBV移植入大鼠体内后,发现netrin-1可促进在血管植入后3-7 d时原位浸润的MΦ转化为抗炎型,之后在14 d时已流出内膜表面,从而实现小口径TEBV的早期炎症消退,为归巢入的干细胞提供良好的再生微环境。二、炎症消退对小口径TEBV内皮化意义及其机制研究本部分我们研究在炎症消退中起关键作用的MΦ对EPCs增殖,迁移和血管生成能力的影响。此基础上在大鼠体内研究了小口径TEBV炎症消退和内皮化关系并探究其作用机制。首先,通过大量对比研究实验找到了提取MΦ外泌体时间、经济成本低且获得纯度高的超高速离心结合蔗糖垫方法,之后提取了不同表型MΦ的外泌体与EPCs共培养,观察其对EPCs功能的影响。结果发现促炎型MΦ外泌体可促进EPCs迁移,但长期存在不利于其增殖,而抗炎型MΦ外泌体则可明显提升EPCs的增殖和基质胶成管能力。Netrin-1修饰的小口径TEBV在植入体内后发现,其内皮化进程与炎症消退息息相关,炎症消退组的TEBV在30 d时完成早期内皮化并保持较长时间通畅,证实了及时促进TEBV炎症消退是其实现早期内皮化的必要条件。在临床血管移植中,炎症总是血栓形成和阻塞血管移植物的重要诱因,本研究将为血管移植物在宿主中的长期存活提供新的视角,也可能为其他炎症性疾病提供有效治疗方法。三、糖尿病下神经元外泌体对血管平滑肌细胞钙化作用及其机制研究本部分研究发现神经外泌体对抑制高糖条件下血管平滑肌细胞(SMC)表型转化和氧化应激具有显著作用,进一步对神经外泌体做质谱分析,发现其中含有大量的抑制氧化应激蛋白prdx-1。电镜和BCA蛋白浓度测定发现高糖状态下神经分泌外泌体的数量锐减,免疫荧光结果显示是这是由于负责囊泡运输的Rab35激活受到抑制。本研究通过外源性递送DENND1A,发现神经元内Rab35被激活,外泌体分泌功能增强恢复。之后,进一步研究了神经元外泌体对SMC作用,发现神经元外泌体可抑制高糖时SMC内的活性氧(ROS)含量升高和蛋白损伤,而其机制可能是因为外泌体可抑制高糖时SMC内线粒体膜通道过度开放和膜电位升高。在SMC培养上清加入神经元外泌体后,高糖所诱导的细胞异常增殖、迁移以及钙化均明显受到抑制,抑制剂组结果证实外泌体的这一作用很可能是通过prdx-1抑制SMC氧化应激实现的。本研究发现了神经细胞对VSMC维持正常表型的重要意义及作用机制,为临床预防和治疗糖尿病血管钙化病变提供了新的治疗策略和理论基础。四、构建二级响应修饰系统诱导小口径TEBV神经重建为保护netrin-1与DENND1A两功能分子在体发挥促进神经长入和调控长入神经功能的作用,本研究针对小口径TEBV植入体内后局部特殊微环境设计构建了外层响应ROS的包裹netrin-1水凝胶和内层响应神经递质ATP的包裹DENND1A水凝胶系统。结果发现TEBV在植入体内后水凝胶可保护因子不扩散与降解,待炎症反应发生局部产生ROS与水凝胶内的硫酮基团反应后,外层胶逐渐水解释放出netrin-1,有效促进了神经纤维生长并导向小口径TEBV外膜,实验组血管外膜在14 d时已见有神经开始长入。神经长入TEBV后释放神经递质ATP浓度逐渐增大,与内层胶内ATP适配体ssDNA发生反应,促使内层胶水解,释放DENND1A进入神经元内,从而激活神经元Rab35进一步促进高糖下外泌体分泌水平,显著降低了糖尿病大鼠TEBV的钙含量与钙盐沉积,提高了血流速度,有效抑制糖尿病下血管平滑肌表型转化导致的内膜增生与钙化,使小口径TEBV在糖尿病模型中保持了较长时间的通畅。本研究同时也为临床预防、延缓及治疗糖尿病血管钙化提供了新策略。
【图文】：

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陆军军医大学博士论文图 7 小口径 TEBV 在植入体内 30 d 早期内皮化过程。(A)各时间段不同组小口径 TEBV 内膜层的扫描电镜图像及内皮细胞数量统计。(B)与A图中各组各时间点对应的小口径TEBV的H&E图像，n=10。3.2.6 netrin-1 修饰的小口径 TEBV 保持长期通畅3.2.6.1 CTA、HE 等显示 netrin-1 修饰的 TEBV 保持 14 个月通畅各组血管在植入 2，6 和 14 个月时我们首先用小动物 micro-CT（CTA）观察其在体通畅，并进一步取出血管冷冻切片做 H＆E 染色。结果显示 MRS 组中 TEBV 在 2个月时已完全闭塞，而 netrin-1 修饰的小口径 TEBV 在 6 和 14 个月时仍保持通畅。 H＆E 染色还发现，netrin-1 修饰的小口径 TEBV 在 14 个月时仍没有平滑肌细胞（SMC）过度增殖和内膜增生（图 8）。
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R54

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