山奈酚对大鼠心肌H9c2细胞凋亡的影响

发布时间：2020-04-01 10:06

【摘要】：背景心力衰竭(heart failue HF),已经成为全球瞩目的公共卫生问题,影响着世界上大约1%-2%的人口,它严重威胁患者健康,使患者劳动能力和生活质量下降,并因此耗费巨大医疗资源,给家庭和社会带来沉重负担。而心室重构(ventricular remodeling)是引起心力衰竭发生的关键环节,贯穿整个心力衰竭的发展。心室重塑是指各种损伤使心脏结构与功能发生变化,是机体的一种适应性反应,具体包括心室重量、大小和形状的改变,微观上涉及心肌细胞、细胞外基质以及两者之间比例的改变,原发性心肌细胞受损、血流动力学负荷等诸多因素都能影响这一过程.细胞凋亡是造成心室重构的一个重要危险因素,基本病理机制如下:细胞凋亡(apoptosis)是指为了机体整体稳定,由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同,细胞凋亡不是被动的过程,而是主动过程,它涉及一系列基因的激活、表达及调控等的作用。研究发现,在心肌的破坏形式中存在凋亡。既往的临床研究发现~([1]),代谢紊乱和神经体液失调均可导致心肌细胞肥大、增生、凋亡、心肌间质纤维化。心肌细胞凋亡造成心室肌细胞不断减少,减少的细胞数目被胶原纤维等细胞外基质替代,导致心肌收缩单元不断减少,最终逐步发展为心力衰竭。引起细胞凋亡的因素很多,其中,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),是凋亡反应中最强烈的刺激因素之一;LPS,又称内毒素,是革兰阴性菌菌外壁的一种成分,是心肌细胞凋亡过程中一个重要的炎症因子来源。LPS释放进入血液后与脂多糖结合蛋白(Lipopolysaccharide binding protein,LBP)结合成复合物,识别结合单核细胞或巨噬细胞表面高亲和力的受体CD14,激活Toll样受体(TLR4),导致NF-IL6、AP-1、CREB及NF-κB等核因子的活化,启动TNF-α、IL-1及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)等炎性因子基因的转录,导致大量炎性因子的产生,引发机体的炎症反应,造成心肌细胞的凋亡。心室重塑的具体机制十分复杂~([2]),除如前所述的心肌细胞间质纤维化、心肌细胞凋亡外,主要机制还有4个方面:(1)代谢障碍致代谢性重构(metabolic remodelling):例如糖尿病性心肌病,血糖异常造成心肌细胞钠钙交换受抑制,而肌浆网Ca~(2+)泵正常,逐渐使Ca~(2+)聚集在肌浆网,进而引起心脏顺应性下降,随之发生心室重构。(2)肾素一血管紧张素系统(rennin—an giotensin system,RAS)被激活:心排血量降低导致肾血流量减低,RAAS激活,心肌收缩力增强、周围血管收缩维持血压,促进醛固酮分泌等,同时激活心脏和血管重塑,加重心肌损伤和心功能恶化程度。(3)心脏自主神经病变:心力衰竭病人代偿性交感神经兴奋,去甲肾上腺素(NE)水平升高,作用于心肌β1肾上腺能受体,增强心肌收缩力并提高心率,从而提高心排血量。周围血管收缩,心脏后负荷增加及心率增快的因素,均可使心肌耗氧量增加,此外NE还对心肌细胞有直接毒性作用,促使心肌细胞凋亡,参与心室重构过程。(4)心肌微血管病变:心肌微血管病变主要指微循环障碍、微血管瘤和微血管基膜增厚,这些因素导致心肌细胞缺血缺氧,引起局灶性细胞凋亡、坏死和心肌间纤维瘢痕灶,导致心室重塑。简言之,在心室重构的演化过程中,多种因素参与心肌细胞增生、肥大和凋亡、心肌间质纤维增生,而细胞凋亡在心室重构晚期发挥着不可或缺的角色,极大的促进心室重构的发生及发展,因此抑制细胞凋亡可有效的逆转心室重构的进展~([1]),但目前临床尚无特异性抑制心肌细胞凋亡的靶向药物,因此寻找有效的逆转心室重构的靶向药物显得尤为重要。从中药有效成分中寻找新药是现代药理学研究的热点,很多中药及有效成分具有降低血脂、抗氧自由基及抗细胞凋亡等血管内皮细胞保护作用的功能。其中山奈酚(Kaempfer01)又名山奈素,化学名为3,5,7.三羟基.2.(4.羟基苯基).4H.1.苯并吡喃4.酮,属于黄酮醇类化合物,主要存在于姜科植物山柰的根茎,也可见于各种水果、蔬菜中。有研究结果~([3-4])提示其具有防癌、抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、保护内皮细胞等作用,还有研究~([4])结果提示山奈酚具有抗心肌细胞肥大及间质纤维化的作用。因此我们认为山奈酚在防治抗心肌细胞凋亡方面具有潜在价值,但其对心肌细胞凋亡的作用尚不明确,因此本研究就山奈酚对心肌细胞凋亡的作用做进一步的探讨。本实验将重点研究山奈酚对心肌细胞活力、心肌细胞凋亡的影响,并观察凋亡心肌细胞的凋亡蛋白表达及信号通路激活水平。目的本研究探讨山奈酚对大鼠心肌细胞凋亡的影响,并进一步研究这些影响的可能机制,为以后研发新药及临床用药提供参考。实验分组与方法实验分组:(1)空白对照组:具有培养基、H9c2细胞;(2)山奈酚组:H9c2细胞+山奈酚,具体亚组分组为:(1)山奈酚5umol/L;(2)山奈酚25umol/L;(3)山奈酚50umol/L;(3)LPS组:H9c2细胞+10mg/L的LPS;(4)共同作用组:H9c2细胞+山奈酚+LPS,具体亚组分组为:(1)LPS10mg/L+山奈酚5umol/L;(2)LPS10mg/L+山奈酚25umol/L;(3)LPS10mg/L+山奈酚50umol/L;实验方法:1细胞活性检测采用CCK-8毒性检测试剂盒来检测不同浓度山奈酚和/或LPS刺激条件下细胞的活力。首先将细胞接种到96孔板中,为提高实验准确性需保证每孔100μL,且密度约维持在2×10~5个/mL,然后置于温箱连续培养24h,再用无血清培养基替换原有培养基,进行18h的饥饿处置,最后采用不同浓度山奈酚和/或LPS处理12h后,并将96孔板中的培养基再次换为含有10μL CCK-8的无血清培养基100μL,并在恒温箱中继续孵育2-2.5h后,再将其置于酶标仪下(波长450 nm)分别检测每孔的OD值,实验重复3次。2细胞凋亡检测培养细胞在胰蛋白酶消化后调整密度为1×10~5个/mL,制作细胞爬行片,并进行饥饿培养18h,后加入不同浓度山奈酚和/或LPS处理细胞12 h,用PBS漂洗3次,再用1%多聚甲醛进行固定10 min,接着用乙醇/乙酸2∶1混合液在-20℃恒温下固定5 min,再次用PBS清洗3 min。加入平衡液室温下孵育10 s后滴加TdT酶工作液,37℃孵育1 h。加入工作液振荡15 s后孵育10 min,PBS洗3次,吸干液体,滴加Anti-Digoxigenin Fluorescein工作液,进行避光孵育约30 min,使用PBS再洗3次,在DAPI封片后,最后进行荧光显微镜下观察拍照。正常的细胞核可被染为蓝色,而凋亡的细胞核则被染为绿色,在每组中随机选择8个视野(×400),记录凋亡细胞数,计算细胞凋亡率(凋亡细胞数÷细胞总数×100%),并取其平均值,实验重复8次。3 Western blot检测H9c2细胞凋亡蛋白表达及信号通路激活水平在冰上进行裂解细胞10 min,然后将其置于1.5 mL离心管中,超声裂解仪5kHz进行10-15 s的裂解,4℃12000 g离心15 min,上清液移至离心管中,BCA定量检测蛋白浓度并加入相同质量的蛋白于200ml EP中进行高温变性。在每组样本混合均匀后取10μL进行10%SDS-PAGE凝胶电泳检,将GAPDH设置为检测的内在参考指标,然后依据各样本的光密度值逐个调整上样剂量,再次对调整后的上样剂量进行凝胶电泳检测,使各样本间GAPDH的光密度值无差异,紧接着对每组以校正后的上样剂量分别进行凝胶电泳检测,将蛋白以200mA、90 min的参数移到PVDF膜上,并使用一抗封闭液进行封闭12 h,其中一抗主要包括p-Iκbα、p-P65、c-Caspase 8、P65、c-Caspase 3、IκBα、c-Caspase 9,封闭12h后再使用TBST进行清洗3次,接着再将各自放入对应的加有二抗的稀释液中进行避光孵育1 h,其中二抗主要为山羊抗兔IgG抗体,孵育结束后再用TBST清洗3次,并将其放入Amersham Imager 600超灵敏多功能成像仪中来检测目的条带,同时应用Gel-Pro Application图像分析软件来分别检测各组蛋白的光密度值,以代替其蛋白表达水平,实验重复3次。4统计学分析采用SPSS23.0统计软件对试验数据进行分析。计量资料以~—x±SD表示,不同组间凋亡蛋白表达及信号通路激活水平的比较采用单因素方差分析,组间两两均数比较采用LSD-t检验,检验水准α=0.05,P0.05认为差异具有统计学意义。结果1.山奈酚对大鼠心肌H9c2细胞活性以及山奈酚对LPS诱导的大鼠心肌H9c2细胞活性的影响的影响:不同处理因素干预12h后,CCK8结果显示,与空白对照组相比,不同浓度山奈酚单独干预H9c2细胞对其活力无影响(P0.05);LPS干预细胞后引起细胞活性显著下降(P0.05),山奈酚(5、25、50μmol/L)与LPS同时干预H9c2细胞,则可呈现浓度依赖性的改善H9c2细胞活性,因此山奈酚能改善LPS诱导的大鼠心肌H9c2细胞活性的下降。2.山奈酚对LPS诱导下H9c2细胞凋亡的影响:细胞经过不同干预因素处理12h后,对照组凋亡率为6.7±0.9%;LPS刺激组可显著增加H9c2细胞中凋亡率(41.2±4.7%);LPS+高剂量山奈酚组以50μmol/L山奈酚处理H9c2细胞12h后,则H9c2细胞中凋亡率降低为10.0±1.3%。这些结果提示山奈酚可以改善LPS诱发的细胞调亡,降低细胞的凋亡率。3.山奈酚对LPS诱导H9c2细胞凋亡蛋白的表达的影响WB结果提示,LPS(10 mg/L)干预大鼠心肌H9c2细胞12 h可显著提高c-Caspase3、c-Caspase8、c-Caspase9的蛋白表达水平,不同浓度山奈酚(5、25、50μmol/L)与LPS共同处理大鼠心肌H9c2细胞12h后,则可显著抑制上述3个凋亡蛋白的表达。4.山奈酚对LPS诱导H9c2细胞中TLR4/NF-κB通路的影响细胞经过不同干预因素处理后,WB结果显示,和LPS处理相比,不同浓度山奈酚(5、25、50μmol/L)与LPS(10 mg/L)协同刺激H9c2细胞可显著抑制LPS诱导的TLR4、Iκbα及P65信号通路的磷酸化水平,对总蛋白无影响(图4-表3)。结论1.不同浓度的山奈酚(5、25、50μmol/L)对大鼠心肌H9c2细胞无明显细胞毒性,且山奈酚可改善LPS诱导的大鼠心肌H9c2细胞活性的下降。2.山奈酚可以减轻LPS诱导的大鼠心肌H9c2细胞的凋亡。3.山奈酚可抑制LPS诱导的大鼠心肌H9c2细胞凋亡蛋白的表达。4.山奈酚可能通过TLR 4/NF-κB途径产生抗心肌细胞凋亡作用。
【图文】：

山奈酚,细胞活性,对照组

10附图图1 山奈酚对H9c2细胞活性的影响B 表 1 不同处理因素细胞凋亡率比较组别 n 细胞凋亡率（%）对照组 8 6.7±0.90LPS 组 8 41.2±4.70*LPS+50μmol/L 山奈酚组 8 10.0±1.30# *F 412.690P ＜0.01*：与对照组比较，P＜0.05；#：与 LPS 组比较，，P＜0.05附图

山奈酚,细胞凋亡,对照组

图 2 山奈酚对 LPS 诱导下 H9c2 细胞凋亡的影响 (TUNEL, ×400)A:对照组；B: 10 mg/L LPS 组；C： 10 mg/L LPS + 50 μmol/L 山奈酚组
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R54

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