甲状腺激素T3促进人诱导性多能干细胞源性心肌样细胞成熟相关作用的研究

发布时间：2020-04-01 10:08

【摘要】：研究背景心血管疾病尤其是急性心肌梗死造成的心源性死亡已经成为全球范围内最主要的死亡原因之一。由于心肌细胞缺乏再生能力,坏死的心肌被纤维瘢痕组织所取代,导致心肌梗死后的心脏发生重构及心室机械功能障碍,最终发展为心力衰竭。因此,如何使梗死区域的心肌细胞数量及功能得到改善,从根本上修复已坏死的心肌组织,是缺血性心脏病治疗中所面临的关键问题。近几年研究已成功将人诱导性多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hi PSCs)分化为心肌样细胞,为心肌梗死的细胞治疗研究提供了巨大动力,是缺血性心脏病干细胞移植治疗的潜在细胞来源。然而,目前由诱导性多能干细胞得到的心肌样细胞(induced pluripotent stem cell-Cardiomyocytes,i PSC-CMs)与成人心肌细胞相比相对不成熟,成熟的心肌样细胞才能更好地体现人类心肌细胞的生理机能,建立更有效的疾病模型和药物筛选体系,取得更佳的细胞移植治疗效果并降低心律失常发生的风险。甲状腺激T3对正常心肌的发育至关重要,能从多方面诱导并促进心肌细胞的成熟。目前有关甲状腺激素T3用于促进人诱导性多功能干细胞源性心肌样细胞(human induced pluripotent stem cell-Cardiomyocytes,hi PSC-CMs)成熟性的相关研究较少,且尚无甲状腺激T3在诱导分化期第0天至第7天促进hi PSC-CMs成熟的相关研究报道。研究目的采用三碘甲状腺素原氨酸(T3)对人诱导性多能干细胞(hi PSC)进行诱导,探讨其在心肌样细胞分化过程中促进hi PSC-CMs成熟的可行性。研究方法(1)抽取健康成人静脉血,利用密度梯度离心法分离培养外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMCs),采用仙台病毒载体将外源性转录因子导入PBMCs,建立人诱导性多能干细胞系;通过形态学观察,碱性磷酸酶活细胞染色、免疫荧光染色,拟胚体形成等方法对hi PSCs进行鉴定;并通过核型鉴定,检测hi PSCs是否发生突变。(2)利用化学既定方法诱导hi PSCs分为心肌样细胞;通过观察其形态学变化,以及Nkx2.5、c Tn T和MLC2v的免疫荧光表达情况,对得到的心肌样细胞进行鉴定。(3)在hi PSCs向心肌细胞诱导分化期间,用甲状腺激素T3进行药物干预。并于药物干预的第7天检测T3组与对照组Nkx2.5、c Tn T、MLC2v等指标的免疫荧光表达情况,行流式细胞学检测细胞周期、线粒体数量变化,通过透射电镜观察细胞内超微结构的差别。研究结果(1)外源性转录因子导入PBMCs后第14天获得典型诱导性多能干细胞克隆;碱性磷酸酶活细胞染色表达强阳性;免疫荧光染色检测显示:OCT3/4、TRA-1-60、TRA-1-81、Nanog、SOX2、SSEA-4等人诱导性多能干细胞特有标记物表达阳性;hi PSCs经悬浮培养形成拟胚体。hi PSCs染色体未出现异常的缺失、扩增或移位。(2)hi PSCs分化得到心肌样细胞,细胞形态由克隆集落逐渐变为多边形或梭形,心肌特有标志物Nkx2.5、c Tn T和MLC2v等免疫荧光表达阳性。(3)甲状腺激素T3组心肌样细胞的Nkx2.5、c Tn T和MLC2v等指标的免疫荧光表达水平与对照组无明显差异;流式细胞学检测T3组细胞周期G1/G0期增多,细胞增殖能力减弱;T3组线粒体数量明显增多;透射电镜显示T3组心肌样细胞与对照组相比糖原、线粒体增多,细胞内出现少量早期肌原纤维,部分细胞之间含有闰盘结构和细胞间紧密连接,其结构较对照组更接近成熟的心肌细胞。结论本实验研究结果表明,可利用仙台病毒系统将外源性转录因子导入PMBCs得到稳定增殖的hi PSCs;并可将hi PSCs诱导分化为足量的心肌样细胞用于进一步研究;且甲状腺激素T3在诱导分化期间可促进心肌样细胞的成熟。
【图文】：

形态特征,集落,仙台病毒

2.15 统计学处理计量数据的统计采用专业统计软件 SPSS 19.0，以 x ±s 表示，组间均数较采用方差分析，两组比较采用 t 检验，P<0.05 表示差异具有统计意义。3、结果3.1 仙台病毒感染 PBMCs 得到 iPSCs在无滋养层条件下，仙台病毒感染 PBMCs 后约第 12 天左右，，培养皿中始出现较为松散的 iPSC（s经过观察发现1x105个细胞/孔形成的克隆最好最多）并呈集落生长，在第 14 天左右，集落生长较致密，边缘清晰，集落内细胞排紧密，细胞核质比高，在转染后的第 20 天左右，克隆生长到肉眼可见的大小使用 0.5mM EDTA 溶液消化挑选克隆，传代至玻连蛋白包被的培养皿中，继贴壁生长。

集落,多能性,干细胞,碱性磷酸酶

图 3-2 冻存复苏 4 天后形成大个 hiPSCs 集落A：40x；B：100x。3.3 碱性磷酸酶活性染色碱性磷酸酶是多能性干细胞的一种表型标记物，在大多数细胞类型中均有表达，但其在多能性干细胞中表达水平明显升高。使用碱性磷酸酶活性染料染色hiPSCs，其结果显示 hiPSCs 碱性磷酸酶表达强阳性。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R54

【参考文献】