骨髓间充质干细胞源外泌体通过传递miR-19b抑制缺氧复氧状态H9c2心肌细胞自噬和线粒体自噬

发布时间：2020-04-02 01:23

【摘要】：研究背景:缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IR)可以造成各种组织器官内细胞结构和功能上的改变,引起细胞的死亡。其中,心肌细胞凋亡是缺血再灌注损伤引起细胞死亡的主要原因。骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem cells,BMSCs)是一种可显著修复梗死心肌、改善心肌重构和心功能的干细胞。现在骨髓间充质干细胞广泛的用于基础研究中,这主要是因为它具有高的增殖活性、容易获得、抗炎症作用以及很小的免疫排斥反应。MSCs的移植治疗心肌梗死中,可以改善心室重塑以及心功能。其发挥主要作用的是细胞的旁分泌机制,而外泌体(exosome,Exo)是干细胞旁分泌效应中发挥主要作用的因子。外泌体是细胞来源的微泡结构,通过传递蛋白与遗传物质来发挥细胞信息传递作用。在缺血再灌注损伤时内源性的干细胞会分泌外泌体至损伤部位修复心肌。既往有关心肌缺氧复氧(Hypoxia reoxygenation,HR)病理生理的研究大多关注于氧自由基、钙超载、炎症反应、线粒体损伤、细胞凋亡、细胞自噬等方面。其中细胞自噬和线粒体自噬被认为在心肌HR中发挥着非常重要的作用。细胞自噬是将受损、变性、衰老的长寿命蛋白及细胞器等底物运输到溶酶体内进行酶解消化,将底物还原为其组成成分并供细胞再利用的过程。线粒体自噬的发生主要是在活性氧物质(Reactive oxygen species,ROS)产生、线粒体受损加重。细胞内的线粒体发生去极化出现损伤,损伤的线粒体被特异性地被包裹进自噬体中并与溶酶体融合,从而完成降解,维持细胞内环境的稳定。氧化应激既可激活线粒体自噬,又可通过破坏自噬调节通路而抑制自噬的发生。体内和体外实验均已证实在缺血再灌注损伤过程中,缺氧阶段,自噬水平适度升高可减轻缺氧所引起的损伤作用,当缺血的心肌组织恢复营养和氧气的供应后,ROS大量聚积,可见自噬显著上调,随着自噬水平的过度增高,通常伴随有心肌自噬性死亡和心肌细胞凋亡的加剧。目前,关于骨髓间充质干细胞源外泌体通过自噬和线粒体自噬调控缺氧复氧(HR)所诱导的心肌细胞凋亡的研究未见报道。本研究拟利用在HR诱导H9c2心肌细胞凋亡的基础上,观察骨髓间充质干细胞源外泌体对H9c2凋亡、自噬及线粒体自噬的影响。探讨外泌体对损伤组织微环境的相互调节机制,为干细胞的非细胞治疗提供新的治疗靶向与策略。第一部分骨髓间充质干细胞源外泌体改善大鼠心肌梗死后心脏功能的体内研究目的:探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)源外泌体对大鼠急性心肌梗死后心功能的影响。方法:(1)采用骨髓差速离心法培养实验所需的大鼠MSCs。利用流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)鉴定生长至P3-P6代的MSCs表面标记抗原(CD29和CD90和CD45);(2)采用超速离心法(UC)分别提取MSCs的细胞培养液的外泌体(Exo);Western Blot检测所提取的外泌体表面标记性的跨膜蛋白CD9、CD63及Alix的表达;透射电镜(TEM)观察外泌体形态学特征;纳米颗粒追踪分析(NTA)分析Exo的内径大小、内径分布范围;(3)将SD大鼠24只随机分为4组:SHAM组、MI组、PBS组、EXO组,每组6只,通过结扎冠状动脉左前降支建立大鼠心梗模型,心肌梗死周边区域注射外泌体、PBS;(4)观察心肌梗死后28天大鼠的心功能的改善情况;(5)心肌梗死14天进行HE染色、MASSON染色以观察心肌组织、纤维蛋白原的变化;(6)心肌梗死第3天提取心肌蛋白观察心肌组织中自噬蛋白的变化;(7)心肌梗死第14天提取心脏组织蛋白测定凋亡蛋白水平的变化。结果:(1)体外分离培养的骨髓间充质干细胞,培养48h后可见部分细胞开始贴壁生长,P3-P6代时细胞呈鱼群状及漩涡状生长,FCM检测表面细胞结果显示:间充质干细胞的阳性表面标记物CD29及CD90分别表高达96.91%和97.66%,阴性标记物CD45表达为1.45%(P0.05)。(2)采用超速离心法(UC)提取出骨髓间充质干细胞源外泌体,蛋白电泳法结果检测显示:Exosome表面标志性蛋白CD9、CD63及Alix均呈阳性表达(P0.05);通过TEM可观察到大小不一、典型的茶托盘状、双层膜结构;NTA结果显示:Exosome平均粒径大小为87.5nm;(3)心电图结果显示结扎冠脉后Ⅱ导联ST抬高,TTC结果可见结扎冠脉后心脏变白;(4)心肌梗死后28天检测大鼠心动图结果显示:与MI组相比,EXO组大鼠心功能的射血分数由30.32%±7.21%,上升到了55.31%±8.33%(P0.05);(5)心肌梗死后14天,取心脏组织行HE染色、MASSON染色,HE染色结果显示MI组心肌组织排列无序,部分心肌细胞已经消失,出现了大量纤维组织的形成,EXO组的心肌组织的完整性较MI有所好转,且纤维瘢痕组织较少。MASSON染色结果显示:EXO组比较于MI组的胶原纤维的数量明有所减少;(6)心梗后第3天测定各组心肌组织的自噬相关蛋白结果显示:与SHAM组相比,MI组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值明显升高,P62有所降低(P0.05)。而与MI组相比,EXO组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值降低,P62蛋白表达水平升高(P0.05);(7)心梗后第7天测定各组心肌组织的凋亡蛋白表达情况,结果显示:与SHAM组相比,MI组的active/pro caspase3比值、Bax蛋白表达升高(P0.05),Bcl-2有所降低(P0.05),而与MI组相比,EXO组active/pro caspase3比值、Bax蛋白表达水平降低,Bcl-2升高(P0.05)。结论:骨髓间充质干细胞源外泌体可以改善大鼠急性心梗后心室重塑及心功能。第二部分心肌细胞自噬和线粒体自噬在骨髓间充质干细胞源外泌体miR-19b改善缺氧复氧诱导H9c2损伤中的作用及机制目的:在MSCs源外泌体改善心梗后心功能的基础上,体外实验建立缺氧复氧模型,研究外泌体是否抑制缺氧复氧状态下H9c2心肌细胞凋亡并减轻细胞自噬及线粒体自噬。以及探讨miR-19b/Bnip3L信号轴在其中发挥的调控作用。方法:(1)以缺氧24h复氧6h建立H9c2心肌细胞凋亡模型。在此基础上400ng/μl的Exosonme处理细胞12h为HR+EXO组,同时加入1nm的雷帕霉素(rapamycin,Rapa)处理细胞12h为HR+EXO+RAPA组,将实验分为:Control组、HR组、HR+EXO组,HR+EXO+RAPA组。采用Annexin V/PI染色,流式细胞术检测细胞凋亡。线粒体荧光探针JC-1染色细胞,在激光共聚焦显微镜上测定线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,△Ψm),用线粒体ROS荧光探针Mitosox Red、ROS荧光探针DCFH-DA染色细胞,在荧光显微镜观察线粒体ROS、细胞ROS水平的变化。采用透射电镜观察自噬体的数量,Western blotting法检测自噬蛋白LC3-I、LC3-II、P62以及线粒体标志蛋白TOMM20、COXⅣ的蛋白变化;(2)通过查询外泌体数据库(microverexpression esicles)以及联合NCBI文献库筛选出MSCs来源的外泌体中与心肌细胞氧化应激最密切的microRNA包括:miR-99a、miR-133、miR-19b、miR-150、miR-410、miR-451;(3)实验分为Control组、HR组、HR+EXO组,分别对上述候选的microRNA进行RT-PCR的定量,筛选出表达变化最为显著的microRNA,。即miR-19b;(4)为验证miR-19b在HR的心肌细胞中抗细胞凋亡、自噬及线粒体自噬中的作用,以life2000~(TM)为载体将miR-19b抑制剂及模拟物及其阴性对照物(50nM)转染至心肌细胞,实验分组为:HR组、HR+miR-19b mimic组、HR+MNC组、HR+miR-19b inhibitor组、HR+INC组,利用Annexin V-FITC/PI检测凋亡细胞、DCFH-DA检测细胞总ROS、Western Blot检测细胞总蛋白的LC3-I及LC3-II,检测线粒体标志蛋白的TOMM20及COXⅣ,JC-1染色线粒体膜电位的变化,线粒体ROS荧光探针Mitosox Red检测线粒体ROS的改变;(5)为验证外泌体通过传递miR-19b发挥抗凋亡、自噬及线粒体自噬作用,实验分为HR组、HR+EXO组、HR+EXO+miR-19b inhibitor组、HR+EXO+INC组,利用同(1)中方法检测细胞及线粒体ROS、线粒体膜电位的变化、自噬水平的变化以及线粒体膜蛋白水平的变化;(6)为验证Bnip3L为miR-19b的潜在靶基因,实验分为Control组、miR-19b mimic组、miR-19b inhibitor组,Western Blot检测Bnip3L蛋白的表达水平的变化;(7)为验证miR-19b与Bnip3L之间的调控关系,利用life2000~(TM)将Bnip3L的质粒转染进入心肌细胞内,实验分为HR组、HR+miR-19b mimic组、HR+miR-19bmimic+pcDNA-Bnip3L,同(1)中方法检测细胞的总ROS、线粒体ROS、自噬水平、线粒体标志蛋白的改变;(8)为验证miR-19b/Bnip3L信号通路在MSCs源外泌体抗细胞凋亡、自噬及线粒体自噬中的调控作用。实验分为HR组、HR+EXO组、HR+EXO+Bnip3L组、HR+EXO+pcDNA-Bnip3L+miR-19b mimc组,使用(1)中方法检测细胞的总ROS、线粒体ROS、自噬水平、线粒体标志蛋白的改变;(9)为验证miR-19b是否是与Bnip3L直接相互作用,设计双荧光素酶报告实验。将之前设计好的r-Bnip3L-3UTR目的质粒rno-miR-19b-1-5p/Negative.Control,加入助转染剂。实验分成:NC mimic+r-Bnip3L-3UTR-WT、rno-miR-19b-1-5p+r-Bnip3L-3UTR-WT、NC mimic+r-Bnip3L-3UTR-mu、rno-miR-19b-1-5p+r-Bnip3L-3UTR-mu,4个组,利用荧光检测试剂盒,Promega Dual-Luciferase system,来对各组的荧光进行测定。结果:(1)体外试验结果显示:与HR组相比,EXO组早期细胞凋亡率有显著降低(P0.05),自噬小体数量显著减少(P0.05),细胞内总ROS及线粒体ROS水平显著下降(P0.05),自噬相关蛋白水平下降(P0.05),线粒体膜蛋白TOMM20和COXⅣ蛋白水平显著增加(P0.05),而在此基础上加入自噬激动剂RAPA后可逆转间充质干细胞源外泌体对缺氧复氧H9c2心肌细胞的抗凋亡、抗自噬及线粒体自噬作用;(2)结合多个数据库筛选出miR-19b、miR-99、miR-133、miR-150、miR-410、miR-451等这6个microRNA;(3)在Control组、HR组、HR+EXO组中,与Control组相比,HR组miR-19b下降最为显著;而与HR组相比,HR+EXO组中miR-19b表达显著增加(P0.05);(4)为验证miR-19b在HR的心肌细胞中抗细胞凋亡、自噬及线粒体自噬的作用,结果显示:与HR组相比,HR+miR-19b mimic组早期凋亡率显著下降(P0.05),并且细胞总ROS及线粒体ROS水平降低(P0.05),细胞的自噬蛋白LC3-II/LC-I的水平降低而线粒体标志蛋白TOMM20及COXⅣ蛋白表达水平增加,然而HR+miR-19b inhibitor组则与之相反(P0.05);(5)为验证外泌体通过传递miR-19b发挥抗凋亡、自噬及线粒体自噬作用,结果显示:与HR+EXO组相比,HR+EXO+miR-19b inhibitor组中细胞早期凋亡率显著上升,细胞总ROS水平、线粒体ROS水平增加,自噬水平增加,线粒体外膜标志蛋白显著降低(P0.05);(6)为验证Bnip3L为miR-19b的潜在靶基因,结果显示:与Control组相比,miR-19b mimic组的Bnip3L的蛋白水平含量明显减降低,miR-19b inhibitor的Bnip3L的蛋白水平含量增加(P0.05);(7)为验证miR-19b通过调控Bnip3L发挥抗凋亡作用,结果显示:与HR+miR-19b mimic组比,HR+miR-19b mimic+pcDNA-Bnip3L组的细胞ROS、线粒体ROS、细胞自噬水平均增加,而线粒体标志蛋白降低(P0.05)。(8)为验证miR-19b/Bnip3L信号通路在MSCs源外泌体抗细胞凋亡、自噬及线粒体自噬中的调控作用,与HR+EXO组相比,HR+EXO+pcDNA-Bnip3L组胞早期凋亡率明显上升细胞总ROS水平、线粒体ROS水平增加,自噬水平增加,线粒体外膜标志蛋白明显降低(P0.05),然而HR+EXO+pcDNA-Bnip3L+miR-19b mimc组则可以显著逆转这种效果(P0.05)。(9)miR-19b与Bnip3L的荧光素酶报告实验结果显示:rno-miR-19b-1-5p未能下调r-Bnip3L-3UTR的luciferase的表达,说明本次实验中两者间未存在直接结合作用。结论:骨髓间充质干细胞源外泌体可通过传递miR-19b,下调缺氧复氧状态下H9c2心肌细胞内Bnip3L表达水平,从而降低细胞自噬及线粒体自噬水平,发挥抗细胞凋亡作用。
【图文】：

骨髓,光镜,标记物,贴壁培养

图 1 骨髓贴壁培养的骨髓间干细胞 A.P3 代 MSCs 在 200 倍光镜下图；B.P3 代 MSC 在 40 倍光镜下的图C.流式细胞学检测P3代MSCs阳性标记物CD29、CD90分别表达96.91±1.9%和97.66±1.8%（P<0.05），阴性标记物 CD45 表达 0.25±0.79%（P<0.05）。2.2 外泌体表面标记物的测定超速离心法（UC）提取的骨髓间充质干细胞来源的 Exosoms，，将外泌体用 BCA定量并变性后，Western Blot 检测标记蛋白 CD9、CD63 及 Alix。实验结果显示：与细胞裂解液蛋白（Cell Lysis）相比，本实验提取的外泌体表面标记 CD9、CD63 以及Alix 分子均呈阳性表达（图 2）。

标记物,骨髓间充质干细胞,性表达,干细胞

养的骨髓间干细胞 A.P3 代 MSCs 在 200 倍光镜下图；B.P3 代 M胞学检测P3代MSCs阳性标记物CD29、CD90分别表达96.91±1.9标记物 CD45 表达 0.25±0.79%（P<0.05）。面标记物的测定（UC）提取的骨髓间充质干细胞来源的 Exosoms，将外Western Blot 检测标记蛋白 CD9、CD63 及 Alix。实验结（Cell Lysis）相比，本实验提取的外泌体表面标记 CD9性表达（图 2）。
【学位授予单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R54

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