肝细胞生长因子对超声引导下球囊损伤后早期新生内膜形成的影响及机制

发布时间：2020-04-05 20:09

【摘要】：心血管疾病(cardiovascular diseases,CVDs)已成为全球范围内首要死亡原因。心血管疾病成为目前疾病防治的重点之一。经皮血管内介入治疗术是目前治疗心血管疾病较为广泛的方法之一,但随之而来的支架植入术后再狭窄(in-stent restenosis,ISR)是介入治疗术后严重的并发症,是临床面临的挑战,成为又一亟待解决的难题。手术操作引起血管内皮细胞损伤及随之发生的血管平滑肌细胞增殖、迁移引起新生内膜组织增生是ISR的重要环节。球囊损伤能够模拟介入治疗手术操作对血管造成的损伤,能够在动物体内复制介入治疗所引起的病理生理学改变。另一方面,分子生物学及基因组学的飞速发展使基因治疗成为可能。HGF是一种多效能生长因子,其在心血管系统的作用存在争议。本研究分三部分,从超声引导下球囊损伤模拟ISR建立动物模型入手,分别探讨兔腹主动脉经皮球囊损伤时不同压力所造成的血管新生内膜组织增生情况,HGF基因转染兔腹主动脉后的在体表达及血管损伤对基因表达的影响,以及HGF基因转染对兔腹主动脉血管损伤后新生内膜形成和内源性rHGF、c-Met表达的影响。通过本研究,为临床解决ISR及心血管相关疾病的诊断及治疗提供可靠的实验数据。第一部分超声引导下兔腹主动脉新生内膜增生模型的建立目的:探讨超声引导下不同压力球囊对血管壁损伤所引起的新生内膜增生的影响。方法:(1)选取新西兰大白兔20只,按照球囊扩张压力不同分为3组:1 atm、5 atm、10 atm组,各5只,另外正常对照组5只。在全麻条件下应用经腹高频超声测量腹主动脉内径,按照球囊内径/血管内径=1.2选择相应球囊。分离右侧股动脉,在超声引导下将球囊送入腹主动脉,至肾动脉水平。充盈球囊,在超声监测下球囊完全阻断腹主动脉血流,根据组别不同分别加压至1 atm、5 atm、10 atm,向下回拉至髂动脉分叉处,重复操作3次,间隔30s。于球囊拉伤前、球囊拉伤术后即刻及2周时测量腹主动脉内径,计算术后即刻扩张率=(术后即刻内径-术前原始内径)/术前原始内径。(2)术后2周,取兔腹主动脉进行HE染色,观察新生内膜形成情况。结果:(1)二维超声:1 atm、5 atm、10 atm组在球囊拉伤过程中球囊紧贴兔腹主动脉壁,彩色多普勒血流成像:球囊与腹主动脉壁间无血流通过。(2)球囊拉伤术后兔腹主动脉内径变化:1 atm、5 atm、10 atm组术后即刻腹主动脉内径均较术前显著增加(P0.05),三组术后即刻扩张率无统计学差异。(3)球囊拉伤术后2周新生内膜形成情况:1 atm、5 atm、10 atm组术后2周可见不同程度新生内膜增生。5 atm和10 atm组新生内膜周长比、面积比和内中膜厚度比均明显大于1 atm组(P0.05),且随着球囊压力增加,新生内膜厚度明显增加(P0.05)。结论:(1)应用超声进行实时引导,能够指导球囊损伤术顺利进行。应用彩色多普勒血流成像观察球囊损伤术中血流动力学变化情况,确保所有实验动物操作的一致性。(2)新生内膜厚度与球囊压力密切相关。第二部分hHGF裸质粒基因转染兔腹主动脉的在体表达及影响因素目的:探讨不同剂量、不同时间点及不同血管状态下hHGF转染兔腹主动脉的在体表达情况。方法:本实验分四部分完成:(1)根据hHGF转染剂量不同分为4组:空质粒组(Con),低剂量组(Low,0.02mg),中等剂量组(Medium,0.2mg),高剂量组(High,2mg),每组各3只。在转染后第3天取兔腹主动脉,应用RT-PCR和ELISA分别检测兔腹主动脉hHGF mRNA和蛋白的表达。(2)根据转染时间点不同,将实验动物分为4组:球囊损伤术后即刻转染组(Op0),球囊损伤术后1天转染组(Op1),球囊拉伤术后3天转染组(Op3),球囊损伤术后7天转染组(Op7),每组各3只。在转染后第3天取兔腹主动脉,应用RT-PCR和ELISA分别检测兔腹主动脉hHGF mRNA和蛋白的表达。(3)根据球囊损伤范围不同,将实验动物分为3组:正常兔腹主动脉hHGF转染组(Nor),部分损伤(1/2)术后即刻转染组(1/2Op),完全损伤术后即刻转染组(Op0),各3只。在转染后第3天取兔腹主动脉,应用RT-PCR和ELISA分别检测兔腹主动脉内hHGF mRNA和蛋白的表达。(4)根据腹主动脉是否存在球囊损伤将实验动物分为2组:正常兔腹主动脉hHGF基因转染组(HGF)和球囊损伤术后7天基因转染组(EI-HGF),各12只。在转染后第3、7、14、21天时取兔腹主动脉,应用RT-PCR和ELISA分别检测兔腹主动脉hHGF mRNA和蛋白的表达。结果:(1)不同剂量hHGF基因转染正常兔腹主动脉的在体表达:转染后第3天Medium组检测到hHGF mRNA和蛋白,Con组、Low组和High组均未检测到hHGF mRNA和蛋白。(2)球囊损伤后不同时间点hHGF基因转染:转染术后第3天Op7组检测到hHGF mRNA和蛋白。Op0组、Op1组和Op3组均未检测到hHGF mRNA和蛋白。(3)不同损伤范围对hHGF基因转染的影响:1/2Op组hHGF mRNA和蛋白表达量明显低于Nor组。Op0组未检出hHGF mRNA和蛋白。(4)hHGF基因转染后在体表达情况:hHGF mRNA和蛋白在体表达峰值出现在转染后第3天,持续时间超过2周。EI-HGF组转染后第3天hHGF mRNA的表达量低于HGF组(P0.05),EI-HGF组转染后第3、7、14天hHGF蛋白表达量低于HGF组(P0.05)。结论:本研究发现球囊损伤范围越大对基因转染的在体表达影响越大;血管损伤降低了hHGF的在体表达;确定基因转染最佳剂量为0.2mg,最佳转染时间点为球囊损伤后第7天,为下一步实验提供研究基础。第三部分hHGF对球囊损伤后兔腹主动脉早期内膜增生的影响及机制目的:探讨外源性hHGF基因转染对球囊损伤后早期新生内膜形成的影响及其机制。方法:55只健康新西兰大白兔,分为4组:单纯球囊损伤组(EI,20只),球囊损伤+hHGF转染组(EI-HGF,15只),球囊损伤+空质粒转染组(EI-V,15只),正常对照组(control,5只)。根据前两部分实验结果,球囊损伤的压力设置为10 atm。hHGF基因转染时间点为球囊损伤术后第7天,转染剂量为0.2mg。于实验第1、2、4、8周分别取兔腹主动脉,进行HE染色观察兔腹主动脉新生内膜情况,应用免疫组织化学染色观察新生内膜rHGF、c-Met、CD31和α-SMA表达情况,应用实时荧光定量RT-PCR检测兔腹主动脉内源性rHGF mRNA、c-Met、α-SMA和e NOS mRNA。结果:(1)hHGF抑制血管损伤后早期新生内膜形成:EI组、EI-HGF组和EI-V组血管损伤术后均可见新生内膜形成,随着时间推移,新生内膜明显增厚。第2周EI-HGF组N/M比值明显小于EI-V组(P0.001)。(2)hHGF改变新生内膜ECs和VSMCs表达及功能:第2周EI-HGF组新生内膜CD31阳性细胞百分比明显高于EI-V组(P0.01)。第2周EI-HGF组兔腹主动脉e NOS mRNA表达量明显多于EI-V组(P0.001)。第2周和第4周EI-HGF组新生内膜单位面积α-SMA阳性细胞数明显少于EI-V组(P0.05)。EI-HGF组兔腹主动脉α-SMA mRNA峰值后移,第2周和第4周表达量明显低于EI-V组(第2周:P0.001;第4周:P0.01)。(3)hHGF引起内源性rHGF和c-Met表达改变:EI-HGF组兔腹主动脉内源性rHGF mRNA表达峰值提前,第2周和4周时,内源性rHGF mRNA明显高于EI-V组(第2周:P0.01;第4周:P0.05)。第2周时EI-HGF组兔腹主动脉c-Met mRNA表达量明显高于EI-V组(P0.05)。结论:外源性给予hHGF能够在球囊损伤术后早期显著抑制新生内膜增生,促进再内皮化,改善内皮功能,抑制平滑肌细胞增殖,其作用可能是通过增加兔腹主动脉内源性rHGF和c-Met mRNA表达而实现。
【图文】：

超声图像,腹主动脉,解剖结构,分支

A B图 2.1 兔腹主动脉解剖结构及超声图像对照。图 A：1～5 为兔肾动脉及以下水平腹主动脉的 5 个分支，，两个白色间为血管损伤的靶。图 B：兔腹主动脉高频超声图像：为图 A 中腹主动脉分支 2、3，╋为腹主动脉管壁。

超声图像,球囊,腹主动脉,球囊损伤

CDFI）：管腔内可见血流充填，血流信号平滑（见图2.2 A、B）。球囊损伤术中，应用高频超声实时观察球囊位置、扩张程度及与腹主动脉关系。二维高频超声显示：未充盈的球囊呈粗线状强回声，CDFI：球囊与血管壁间可见血流通过。二维高频超声显示：充盈后的球囊呈三条细线状强回声，球囊前后壁紧贴于血管前后壁，CDFI：球囊充盈后，球囊与血管壁间无血流通过（见图 2.2 C-F）。2.3.2 球囊损伤术后腹主动脉内径变化分别在球囊损伤术前、术后即刻及 2 周时，应用高频超声测量兔腹主动脉内径。球囊损伤术前，1 atm、5 atm 和 10 atm 组腹主动脉内径比较，无统计学差异（P>0.05）。球囊损伤术后即刻 1 atm、5 atm 和 10 atm 组腹主动脉内径均较术前明显增加，有统计学差异（P<0.05），各组间比较无统计学差异（P>0.05）。球囊损伤术后 2 周 1 atm、5 atm 和 10 atm 组腹主动脉受血管弹性回缩影响
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R54

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