miR-124-3p介导IL-1β调节平滑肌细胞胶原合成及其对动脉粥样硬化斑块的影响

发布时间：2020-04-05 21:00

【摘要】：研究背景根据2017年全球疾病负担报告,心血管疾病(Cardiovascular diseases)造成了将近1,800万人死亡,较10年前增长了约21.1%,心血管疾病已经连续数年成为人类健康的头号杀手。AS作为心血管疾病的主要病理基础,其特点是受累动脉从内膜开始,先后出现脂质沉积、纤维增生及钙质沉着,动脉中膜逐渐退变及钙化,并可发生斑块内出血、斑块破裂及局部血栓形成。研究表明,临床心血管事件多由不稳定斑块引起,AS斑块的稳定性主要由脂质核心大小、炎性细胞浸润及炎症反应程度以及纤维膜的厚薄决定。因此,探讨影响动脉粥样硬化斑块稳定性的因素及其具体机制对AS的防治具有重要的临床意义。易损斑块往往具有较薄的纤维帽,而纤维帽的形成及其完整性的维持主要依靠ECM,血管平滑肌细胞(VSMC)为ECM的主要来源。胶原为ECM的主要成分,其中又以Ⅰ型及Ⅲ型胶原表达量最高。胶原的代谢包括合成与降解两部分。近年来,对胶原代谢的研究主要集中在其降解过程,对平滑肌细胞内胶原合成过程及其调控机制的相关研究较少。胶原的合成需要羟化酶及糖基化酶的辅助,其中辅氨酰-4-羟化酶(P4H)对胶原形成稳定的三螺旋结构具有重要作用。miRNA是一类非编码RNA,近年来研究发现它们参与了多种生理以及病理过程的调节。已有多种miRNA被证实在AS的发生发展过程中起到了重要的调控作用。miR-1]24-3p为一种在体内多种器官组织中表达的miRNA,最初在神经系统内被发现,可以促进神经元的成熟,与多种神经系统疾病密切相关;还被证实能够抑制多种肿瘤的增殖、迁移,从而起到抑癌作用。最近有研究发现,miR-124-3p的血清含量在吸烟的冠心病患者中,与心血管事件的发生风险成正相关。然而其对动脉粥样硬化的作用及机制尚未明了,仍待进一步研究。研究目的1.明确miR-124-3p对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块中组织成分及稳定性的影响;2.观察miR-124-3p在斑块中的分布并探讨miR-124-3p对血管平滑肌细胞胶原代谢的影响及其机制。研究方法1.Lenti-miR-124-3p慢病毒的构建应用慢病毒载体pGLV3/H1/GFP+Puro构建小鼠miR-124-3p过表达(miR-124-3p mimic)慢病毒及miR-124-3p抑制(miR-124-3p inhibitor)慢病毒。2.构建动物模型60只8周龄ApoE-/-雄性小鼠,2周普通饮食适应性喂养后改用高脂饲料喂养12周,随机分3组,于取材前四周行尾静脉注射:(1)空白对照组(n=20):其中18只注射2×107TU的Lenti-GFP(NC组),另随机选取2只注射等量生理盐水(NS组)用于检测转染效率;(2)miR-124-3p过表达组(n=20):注射2×107TU携带miR-124-3p mimic的慢病毒;(3)miR-124-3p抑制组(n=20):注射2×107TU携带miR-124-3p inhibitor的慢病毒。2周后检测慢病毒转染效率,4周后取材。3.动物取材采用腹腔注射戊巴比妥钠法麻醉小鼠,称量体重后固定。心尖取血处死小鼠,留取血清,检测血脂水平。剥离小鼠主动脉,并留取心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏,根据需要选择甲醛固定或者液氮(后转移至-80℃)保存。4%多聚甲醛固定主动脉根24h后流水冲洗,用OCT进行包埋,-80℃保存。染片前用冰冻切片机行厚度5μm连续切片。4.组织蛋白提取及浓度测定取-80℃保存的小鼠主动脉弓段,按照每1mg组织加入110μl蛋白裂解液(RIPA)将组织浸泡在相应体积的RIPA中,用组织匀浆机匀浆后消化,离心后取上清液。采用BCA试剂盒测量蛋白浓度,然后加入蛋白上样缓冲液,煮沸变性。5.蛋白质印迹法(Western blot,WB)根据测量的蛋白浓度计算相应上样体积,最终按1Omg/孔点样,经电泳及湿转转膜后,孵育一抗于4℃过夜,次日洗膜,孵育二抗后行化学发光,留取图片并分析条带灰度值。6.大体油红O染色将固定后的整条主动脉纵向剖开,用油红O染液于室温下浸染2个小时,利用温水分化,后于大体显微镜下观察并剥离血管外膜,将血管展平后拍照。7.组织切片染色主动脉根部冰冻切片染色观察AS斑块相关指标。利用HE染色、油红O染色、天狼猩红染色显示斑块大小及脂质、胶原含量,利用巨噬细胞及平滑肌细胞的特异性抗体MOMA-2及α-SMA进行免疫组化染色观察斑块内巨噬细胞及平滑肌细胞的含量。此外,还利用Ⅰ型及Ⅲ型胶原抗体及P4HA1抗体、MMP2及MMP9抗体对斑块内的相应蛋白进行免疫组化染色以显示其表达量。8.荧光原位杂交(FISH)与免疫荧光染色设计地高辛标记的miR-124-3p探针,利用荧光原位杂交技术显示斑块内miR-124-3p的分布,同时利用平滑肌细胞(α-SMA)、内皮细胞(endomucin)及巨噬细胞(MOMA-2)的特异性抗体行免疫荧光染色后与miR-124-3p进行共定位,观察miR-124-3p在不同种类细胞内的分布情况。9.平滑肌细胞培养及处理实验使用的人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)购自美国Sciencell公司,细胞培养基亦采用同公司生产的SMCM。细胞于37℃,含5%CO2的细胞培养箱内培养。构建体外转染用的miR-124-3p mimic及inhibitor序列,利用Lipofectamine 2000对平滑肌细胞进行转染,调控细胞内miR-124-3p表达。10.逆转录荧光定量PCR(RT-qPCR)动物组织RNA利用Qiagen的miRNA提取试剂盒提取,步骤按照说明书。细胞则利用TRIzol法提取总RNA。利用Nanodrop测定RNA浓度后根据逆转录试剂盒说明,对mRNA及miR-124-3p分别进行逆转录。之后利用SYBR及特异性引物进行实时定量PCR反应。测定Ⅰ型、Ⅲ型胶原及P4HA1的mRNA以及miR-124-3p的表达情况。11.构建含有P4HA1 mRNA 3'UTR序列的荧光素酶报告基因质粒构建含有人的野生型P4HA1mRNA 3'非编码区(3'UTR)序列和突变型P4HA1 mRNA 3'UTR序列的双荧光素酶报告基因质粒:P4HA1 3'UTR wild和P4HA1 3'UTR mut。利用 Lipofectamine 2000将miR-124-3p mimic及其对照和两种质粒分别共转染HASMCs,48h后检测荧光素酶活性。12.RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)miRNA通过与Ago蛋白形成沉默复合体与靶基因的mRNA相结合,其中Ago2为最常见的载体蛋白。分别将转染了miR-124-3p mimic及其对照的平滑肌细胞通过试剂盒行RIP实验,利用Ago2蛋白抗体拉下与Ago2结合的RNA,再行RT-qPCR检测其中P4HA1 mRNA的含量。13.统计分析实验数据均以均数±标准差表示,应用Graphpad Prism 6.0做统计分析及统计图表绘制。配对或非配对t检验用于两组样本间比较,多样本间比较应用ANOVA单因素方差分析,认定P0.05为具有显著统计学差异。研究结果1.动物一般情况3组ApoE-/-小鼠的体重及血清血脂水平均无显著统计学差异,提示miR-124-3p对小鼠的血脂及体重无明显影响。2.慢病毒转染效率及表达效率检测慢病毒经尾静脉注射两周后取NC组及NS组各2只小鼠行主动脉根部冰冻切片观察,可见与NS组相比,注射空白慢病毒的NC组斑块内出现明显绿色荧光,表明转染有效。慢病毒注射四周后取材,分别取NC组、miR-124-3p mimic组及miR-124-3p inhibitor组小鼠各3只,主动脉弓段提RNA并行RT-qPCR检测miR-124-3p水平。与NC组相比,miR-124-3p mimic组miR-124-3p表达水平上调,miR-124-3p inhibitor组表达下调。证明利用慢病毒对血管miR-124-3p的表达调控有效。3.miR-124-3p可增加斑块易损性3组小鼠主动脉根部行冰冻切片,染色结果显示:经大体油红O及HE染色可见斑块面积没有明显的统计学差异;然而,染色显示与NC组相比,miR-124-3p mimic组内胶原含量减少、斑块内平滑肌细胞含量下降,而miR-124-3p inhibitor组斑块内胶原含量增加、平滑肌细胞含量增加;此外,3组间脂质含量及巨噬细胞含量无明显组间差异。4.miR-124-3p抑制斑块内Ⅰ型及Ⅲ型胶原的表达主动脉根冰冻切片的免疫组化染色显示,与NC组相比,miR-124-3p mimic组斑块内的Ⅰ型及Ⅲ型胶原表达减少,miR-124-3p inhibitor组斑块内Ⅰ型及Ⅲ型胶原表达增加。我们还检测了斑块内胶原合成限速酶P4HA1及降解相关酶MMP2、MMP9的表达情况,发现miR-124-3p过表达组P4HA1表达含量下降而miR-124-3p抑制组P4HA1表达含量上升,MMP2及MMP9表达未见明显组间差异。5.miR-124-3p主要分布在平滑肌细胞中取NC组小鼠主动脉根部冰冻切片,FISH及免疫荧光染色共定位显示,在动脉粥样硬化斑块中,miR-124-3p与α-SMA产生的荧光共定位数量最多,表明在斑块中,miR-124-3p主要分布在平滑肌细胞内。6.miR-124-3p降低平滑肌细胞内胶原及P4HA1的表达体外培养人主动脉平滑肌细胞,转染miR-124-3p mimic,miR-124-3p inhibitor或对照(NC)后,WB结果显示相较于NC组,miR-124-3p mimic组平滑肌细胞内Ⅰ型及Ⅲ型胶原表达减少,P4HA1表达减少,而miR-124-3p inhibitor组Ⅰ型及Ⅲ型胶原表达增加,P4HA1表达增加。检测细胞内MMP2及MMP9的表达量,组间未见明显统计学差异。7.P4HA1是miR-124-3p的靶蛋白经软件预测,人及小鼠P4HA1 mRNA的3'UTR区均存在miR-124-3p的可能结合位点。经体外HASMCs的双荧光素酶实验显示,共同转染miR-124-3p mimic与野生型P4HA1 3'UTR双荧光素酶报告质粒的细胞中,萤火虫荧光素酶相对表达量下降,证实miR-124-3p可与P4HA1 mRNA的3'UTR端直接结合。此外,RIP实验结果显示,转染了miR-124-3p mimic的平滑肌细胞中被Ago2抗体拉下的RNA中P4HA1 mRNA的表达量较转染对照的细胞显著增加,提示miR-124-3p可以增加P4HA1 mRNA与Ago2的结合,抑制了P4HA1 mRNA的转录后活性。结论1.miR-124-3p可通过降低动脉粥样硬化斑块内平滑肌细胞及胶原含量降低其稳定性;2.斑块中miR-124-3p主要分布在平滑肌细胞中,并通过作用于P4HA1影响Ⅰ型及Ⅲ型胶原合成。研究背景炎症反应学说是动脉粥样硬化(AS)发生发展的重要机制之一,传统危险因素如高脂血症、高血压、糖尿病等均可通过炎症促进动脉粥样硬化的发展,在这些过程中有多种炎症细胞、炎症因子参与。IL-1β在AS过程中起到重要作用,可以激活下游的IL-6、TNF-α等二级炎症因子,促进炎症反应的放大效应。实验证实,IL-1β或其受体IL-1R敲除的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块明显变小。我们前期实验中发现,miR-124-3p通过作用于平滑肌细胞内胶原合成限速酶P4HA1影响胶原合成。炎症与胶原合成也密切相关,有研究证实,IL-1β可以激活基质金属蛋白酶家族(MMPs),从而加速胶原的降解,使AS斑块稳定性下降。目前IL-1β的抗体逐渐开始应用于临床治疗,CANTOS研究显示,IL-1β的抗体Canakinumab可显著降低心血管病的风险。然而针对Canakinumab在ApoE-/-小鼠晚期AS斑块中作用的实验显示,IL-1β抗体的应用使晚期斑块内胶原及平滑肌细胞含量减少。因此,IL-1β对胶原代谢的具体调控机制仍待进一步研究。miRNA参与到多种病理生理过程中,发挥重要调控作用。研究发现在不同的细胞中,炎症因子可以通过多种miRNA影响MMP及TIMP家族的酶表达及活性。但IL-1β及其下游的TNF-α、IL-6等炎症因子是否可以引起miR-124-3p的改变,以及通过miR-124-3p对胶原合成过程的影响尚未见报道。研究目的1.明确炎症因子IL-11β、TNF-α、IL-6刺激对平滑肌细胞内miR-124-3p表达的影响;2.探讨miR-124-3p是否参与了IL-1β对平滑肌细胞内胶原代谢的调节过程;3.探讨IL-1β调节miR-124-3p表达的分子机制。研究方法1.体外人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)的培养HASMCs购自美国Sciencell公司,其专用平滑肌细胞培养基(SMCM)亦够自同一公司。按照操作规范进行细胞复苏与传代,细胞培养于37℃,5%CO2浓度的细胞培养箱中。6-10代细胞用于实验。2.炎症因子刺激平滑肌细胞观察miR-124-3p表达6-10代HASMCs种板后给予TNF-α 100ng/ml刺激0、1、3、6h;给予IL-6100ng/ml刺激0、1、3、6h;给予IL-1p 1Ong/ml刺激0、1、3、6、12、24h,观察不同炎症因子在不同时间点是否对miR-124-3β表达产生影响,收集细胞后提RNA,利用RT-qPCR检测miR-124-3p的表达水平。明确IL-1β刺激引起miR-124-3p表达改变的合适时间后,选择0、2.5、5、10ng/ml的IL-1β刺激HASMCs 6h,明确IL-1β刺激引起miR-124-3p表达改变的合适浓度。选择适宜的刺激时间及浓度,用于后续研究。3.细胞转染6-10代HASMCs种板后利用lipo2000进行miR-124-3p mimic、miR-124-3p inhibitor或对照的转染,依照实验分组给予刺激,转染24-48h收集细胞。6-10代HASMCs种板后利用lipo2000进行c-Rel siRNA或c-Rel过表达质粒的转染,按照分组给予相应刺激,转染24-48h后收集细胞。4.逆转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)细胞刺激24h后利用TRIzol法提取总RNA,逆转录试剂盒逆转得到cDNA后用SYBR Green荧光定量试剂盒进行qPCR,检测miR-124-3p及c-Rel mRNA等RNA含量。5.蛋白质印迹法(Western Blot,WB)细胞刺激结束后利用蛋白裂解液提取细胞总蛋白,4℃ 14000rpm离心10min,取上清,加入5×蛋白上样缓冲液,99℃ 10min蛋白变性。配制凝胶,按照顺序点样后电泳,利用半干转方法转膜,封闭后于4℃孵育一抗过夜,次日洗膜后于室温孵育二抗1h,洗膜后进行化学发光。检测细胞内Ⅰ型、Ⅲ型胶原,P4HA1,c-Rel等蛋白的表达情况。6.ELISA检测细胞经IL-1β刺激后收集细胞培养基,利用ELISA检测试剂盒检测其中Ⅰ型前胶原的含量。7.荧光素酶实验构建含有miR-124-3p启动子全长的萤火虫荧光素酶基因报告质粒(Promoter),将其与海肾荧光素酶质粒(pRL-TK)共同转染HASMCs 48h后用IL-1β刺激6h,利用双荧光素酶(DLR)检测试剂盒检测萤火虫荧光素酶相对强度。Promoter与pRL-TK共同转染HASMCs,与此同时,用c-Rel siRNA及其对照或pEGFP-c-Rel及其对照转染细胞,48h后利用DLR检测试剂盒检测荧光强度。8.统计分析实验数据均采用均数±标准差表示,应用Graphpad Prism 6.0软件进行数据统计分析及统计图的绘制。两样本间比较使用非配对t检验,多样本间比较使用ANOVA单因素方差分析,P0.05认为存在显著统计学差异。研究结果1.IL-1β上调HASMCs中miR-124-3p的表达给予不同时间梯度的TNF-α、IL-6及IL-1β刺激HASMCs,提RNA后行RT-qPCR,结果显示TNF-α与IL-6对miR-124-3p表达的影响均不明显;而给予IL-1β刺激后,与Oh相比,6h后平滑肌细胞中miR-124-3p表达明显升高。给予不同浓度的IL-1β刺激HASMCs 6h,与Ong/ml相比,IL-1β可在1Ong/ml明显上调miR-124-3p的表达。2.IL-1β使平滑肌细胞前胶原及胶原表达减少Elisa结果显示IL-1β刺激平滑肌细胞后细胞培养基内的Ⅰ型前胶原含量较对照组明显减少。细胞提蛋白后用Western blot检测其中Ⅰ型及Ⅲ型胶原含量,结果显示与对照组相比,IL-1β刺激组细胞内的Ⅰ型及Ⅲ型胶原明显减少。3.miR-124-3p参与IL-1β诱导的HASMCs胶原合成抑制HASMCs转染miR-124-3p inhibitor 24h后给予IL-1β 10ng/ml刺激,细胞提蛋白行Western blot,结果显示,miR-124-3p inhibitor能够一定程度缓解IL-1β对胶原的下调作用。此外,HASMCs转染miR-124-3p mimic或inhibitor后给予IL-1β 10ng/ml刺激,Western结果显示miR-124-3p mimic可使IL-1β对P4HA1的下调作用进一步增加,而miR-124-3p inhibitor可缓解这一下调作用。4.IL-1β通过上调c-Rel促进miR-124-3p的表达Western blot检测不同时间点IL-1β刺激HASMCs后细胞内c-Rel的蛋白表达情况,结果显示,刺激1h后c-Rel表达已上升,3h后c-Rel的表达达高峰,6h后逐渐下降。向HASMCs内转染c-Rel siRNA可以抑制IL-11β引起的miR-124-3p表达上调,而向HASMCs内转染c-Rel过表达质粒则可进一步增加miR-124-3p的表达。向HASMCs内转染c-Rel siRNA后Western blot结果显示与对照组相比c-Rel小干扰组P4HA1、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ 的表达均增多。而向 HASMCs内转染c-Rel过表达质粒后Western blot检结果显示与对照质粒组相比,c-Rel过表达组P4HA1、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表达均减少。5.miR-124-3p是c-Rel的靶基因将miR-124-3p Promoter质粒与pRL-TK共同转染HASMCs 48h后用 IL-1β刺激6h,DLR检测结果显示,IL-1β可使萤火虫荧光素酶相对活性增强,提示IL-1β可以激活miR-124-3p启动子的转录。此外,Promoter与pRL-TK共同转染HASMCs,与此同时,用c-Rel siRNA及其对照或pEGFP-c-Rel及其对照转染细胞,DRL检测结果显示,转染c-Rel siRNA可以使萤火虫荧光素酶活性下降;而转染pEGFP-c-Rel质粒,可以使萤火虫荧光素酶活性升高,提示c-Rel可以增强miR-124-3p启动子的转录活性。结论1.IL-1β上调平滑肌细胞中miR-124-3p的表达;2.miR-124-3p参与了IL-1β对平滑肌细胞内胶原表达的调节;3.IL-1β通过转录因子c-Rel增强miR-124-3p的转录活性。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R543.5


本文编号：2615524