短链酰基辅酶A脱氢酶在心力衰竭中的作用

发布时间：2020-04-07 19:49

【摘要】：目的:短链酰基辅酶A脱氢酶(short-chain acyl-CoA dehydrogenase,SCAD)是脂肪酸β氧化的关键酶,与心脏能量代谢密切相关。然而,SCAD在心力衰竭中的变化以及其对能量代谢的调节作用还不明确。本文通过建立不同的心力衰竭大鼠模型以及在心力衰竭病人人体水平上探讨SCAD的表达变化,并观察腺病毒介导SCAD过表达对心肌细胞凋亡和心肌梗死致心力衰竭大鼠的影响,进一步明确SCAD在心力衰竭中的作用。方法:1.建立20月龄自发性高血压大鼠致慢性心力衰竭模型。通过超声心动图、血压、左室重量指数、Masson三色染色、DHE染色、透射电镜评价心脏病理学和超微结构的改变;线粒体JC-1法和线粒体膜肿胀检测线粒体功能;TUNEL凋亡染色,RT-PCR和Western Blot检测SCAD及上游信号分子PPARα、凋亡蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax的表达变化,检测SCAD酶活性、ATP含量、心肌和血清游离脂肪酸含量,分析慢性心力衰竭中心肌凋亡的情况,研究SCAD在慢性心力衰竭中的变化及其与心脏能量代谢的关系。2.采用SD大鼠冠状动脉左前降支结扎法(Left anterior descending coronary artery ligation,LAD)建立心肌梗死致心力衰竭模型,进一步研究SCAD在心肌梗死致心力衰竭中的变化及其与心脏能量代谢的关系;同时,在运动康复训练的干预下,研究SCAD在其中的变化趋势,以确定SCAD在心力衰竭中是否具有积极的保护作用。通过超声心动图、血压、Masson三色染色、DHE染色、透射电镜评价心脏病理学和超微结构的改变;线粒体JC-1法和线粒体膜肿胀检测线粒体功能;TUNEL凋亡染色,RT-PCR和Western Blot检测SCAD及上游信号分子PPARα、凋亡蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax的表达变化,同时检测SCAD酶活性、ATP含量、心肌和血清游离脂肪酸含量,分析评价心力衰竭心肌凋亡情况和能量代谢的变化。3.通过构建目的基因SCAD的腺病毒载体,寻找最佳的转染滴度使SCAD在心肌细胞内达到最佳的表达丰度。在叔丁基过氧化氢(tert-butyl hydroperoxide,tBHP)刺激心肌细胞建立心肌细胞凋亡模型前,采用腺病毒介导的SCAD过表达进行预处理,通过RT-PCR和Western Blot检测SCAD的表达变化,CCK-8检测细胞增殖和活力,Hochtest33258/PI检测细胞凋亡,观察凋亡蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax的表达变化,同时检测SCAD酶活性、ATP含量、心肌和血清游离脂肪酸含量,分析评价心肌细胞的凋亡情况和能量代谢的变化。4.采用腺病毒多点注射心室壁的方法建立大鼠心肌SCAD过表达模型,Western Blot检测SCAD在心脏中的表达变化,确定持续过表达时间。通过超声心动图、血压、Masson三色染色、DHE染色、TUNEL染色评价LAD术后SCAD过表达对心脏病理学的影响;RT-PCR和Western Blot检测SCAD、凋亡蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax的表达变化,同时检测SCAD酶活性、ATP含量、心肌和血清游离脂肪酸含量,分析评价心肌凋亡情况和能量代谢的变化。5.选取年龄匹配的正常人和心力衰竭病人的心脏切片,采用SCAD免疫荧光法观察SCAD的变化趋势,探讨人体水平上,SCAD是否也具有相同的变化趋势,进一步确定SCAD作为心力衰竭药物治疗新靶点的可能性,为心力衰竭的临床治疗提供一定的启示。结果:1.超声心动图结果显示,20月龄自发性高血压大鼠能成功复制慢性心力衰竭大鼠模型,心力衰竭大鼠的心功能各项指标明显失衡,心力衰竭后期SHR持续的高血压状态出现显著降低,可能与心力衰竭心脏的舒缩功能下降有关。慢性心力衰竭心脏出现明显的心肌纤维化、心肌凋亡和左室病理重构,心肌细胞的超微结构受到明显损伤,线粒体肿胀,线粒体膜电位下降,活性氧过度沉积和过度自噬加速心力衰竭的进程。同时,我们发现,SCAD的表达在慢性心力衰竭中出现了显著下调,SCAD酶活性明显降低,心肌和血清游离脂肪酸大量沉积,ATP含量明显降低。2.SD大鼠心脏行冠状动脉左前降支结扎术4周后,超声心动图结果显示,大鼠LAD术后4周成功复制了心肌梗死后心力衰竭模型,后续进行持续10周的游泳运动干预。单纯的LAD大鼠组,心脏病理学和心肌细胞超微结构,SCAD及其上游信号分子PPARα、凋亡因子表达变化,脂肪酸能量代谢变化与慢性心力衰竭大鼠的结果趋势一致。有氧运动干预10周后,心力衰竭游泳组大鼠的心力衰竭进程受到明显的抑制,同时,SCAD及其上游信号分子PPARα表达显著提高,心脏能量代谢障碍得到明显的改善,心功能明显提升。3.腺病毒介导的SCAD过表达预处理下,能显著抑制由tBHP引起的心肌细胞凋亡,同时,心肌细胞的能量代谢障碍得到明显的改善。4.SD大鼠心脏行冠状动脉左前降支结扎术的同时,进行左室壁多点注射腺病毒,腺病毒介导的SCAD在心脏过表达能显著改善由于LAD术后引起的心力衰竭相关的心脏病理学变化和能量代谢障碍。5.SCAD免疫荧光结果发现,心力衰竭病人的心脏组织中,SCAD的表达变化与心力衰竭大鼠的变化趋势一致,均呈现负性调节作用。结论:SCAD与心力衰竭密切相关,并与心力衰竭呈负性调节作用。SCAD作为心脏脂肪酸代谢供能环节的关键酶,提高SCAD的表达能显著抑制心肌细胞凋亡,抑制心力衰竭进程,主要原因可能与能量代谢和线粒体凋亡通路的干预有关,SCAD具有成为心力衰竭药物治疗新靶点的可能性。
【图文】：

超声心动图,超声心动图,大鼠,血压

图 2-1 各组大鼠超声心动图比较及参数的变化Figure2-1 Representative charts of transthoracic M-mode echocardiogram and the changes ofechocardiogram parameters in rats.Compare with WKY group,aP<0.05 ,x±s, n =3．2.5.2 慢性心力衰竭大鼠的血压变化情况（表 2-1)与 WKY 对照组相比，SHR 组大鼠的血压明显升高(P<0.05)；WKY 对照组4-9 月龄血压为 110-120 mmHg，10-20 月龄血压有所上升并维持在 130-140mmHg(P<0.05)；SHR 组 4-13 月龄血压有所上升并维持在 200 mmHg 左右，14月龄后血压下降并维持在 170mmHg(P<0.05)。以上结果表明，正常大鼠随着年龄的增长，血压有持续上升的趋势；SHR 大鼠在 14 月龄前随着年龄的增长，血压持续上升，但在 14 月龄后血压明显下降(P<0.05)，提示自发性高血压大鼠后期转变为慢性心力衰竭的过程血压会有所降低，可能与心肌泵血能力障碍有关。

心脏形态学,心肌纤维化,胶原沉积,染色法

te：Compared with WKY control group，aP<0.01，x±s，n=6.5.4 慢性心力衰竭大鼠的心脏形态学检查（图 2-2）Masson 染色法结果显示，老年 WKY 大鼠无明显心肌纤维化；老年腔增大，，胶原沉积明显增多，心尖部分区域室壁明显变薄。
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R541.6

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