体外震波抑制心肌细胞凋亡的机制研究

发布时间：2020-04-15 10:57

【摘要】：[目的]通过体外细胞实验验证CSWT预处理能否抑制缺氧/复氧诱导的H9C2细胞凋亡,并进一步探讨CSWT是否通过激活PI3K/Akt、ERK1/2信号通路发挥抑制H9C2细胞凋亡的作用,同时揭示以上2个信号通路在CSWT抑制H9C2细胞凋亡的效应中是否有协同。为将来探讨CSWT预处理缺血再灌注损伤患者保护效应的相关临床研究提供理论依据,也为今后进一步拓展CSWT治疗缺血性心脏病(IHD)的分子机制研究奠定基础。[方法]选用来源于胚胎期大鼠心脏组织的H9C2细胞作为研究对象,分为正常对照组(control组)、缺氧/复氧组(A/R组)、CSWT+缺氧/复氧组(CSWT+A/R组)、LY294002+缺氧/复氧组(LY294002+A/R 组)、PD98059+缺氧/复氧组(PD98059+A/R 组)、LY294002+PD98059+缺氧/复氧组(LY294002+PD98059+A/R 组)、LY294002+CSWT+缺氧/复氧组(LY294002+CSWT+A/R 组)、PD98059+CSWT+缺氧/复氧组(PD98059+CSWT+A/R 组)、LY294002+PD98059+CSWT+缺氧/复氧组(LY294002+PD98059+CSWT+A/R 组),其中 LY294002、PD98059 分别为PI3K/Akt、ERK1/2信号通路抑制剂。予以CSWT预处理(每份标本均以0.09mJ/mm2能量水平给予500个脉冲波),运用模拟缺血/再灌注液培养法构建H9C2细胞缺氧/复氧模型,应用CCK8比色法、流式细胞技术分别检测各组细胞的存活及凋亡情况,RT-PCR检测各组细胞培养物中Bcl-2、Bax、Caspase-3的mRNA 转录情况;Western-blot 检测细胞培养物中 Bcl-2、Bax、Caspase-3、p-AKT、p-ERK1/2的蛋白表达水平。为进一步研究CSWT预处理是否通过PI3K/Akt信号通路、ERK1/2信号通路调控缺氧/复氧诱导H9C2细胞的凋亡,予LY294002、PD98059预处理细胞分别阻断上述两条通路,同样的检测各组心肌细胞的增殖及凋亡情况,各组细胞培养物中Bcl-2、Bax、Caspase-3的mRNA转录情况及Bcl-2、Bax、Caspase-3、p-AKT、p-ERK1/2 的蛋白表达水平。[结果]1、CCK8法检测各组H9C2细胞存活率情况:与Control组比,A/R组细胞存活率降低(73.40±5.23 vs 100.00±3.34,P0.05)。与 A/R组细胞存活率(73.40±5.23)相比,LY294002+A/R组(49.22±3.63)、PD98059+A/R组(60.97±4.48)细胞存活率降低(P均0.05),A/R+CSWT组(96.88±6.55)细胞存活率增加(P0.05)。与 A/R+CSWT 组(96.88±6.55)相比,Ly294002+A/R+CSWT 组(67.01±4.71)、PD98059+A/R+CSWT 组(77.29±1.55)细胞存活率降低(P 均0.05)。与LY294002+A/R 组(49.22±3.63)相比,Ly294002+PD98059+A/R 组(41.06±1.42)细胞存活率降低,PD98059+A/R组(60.97±4.48)细胞存活率增加(P均0.05)。与 PD98059+A/R 组(60.97±4.48)相比,Ly294002+PD98059+A/R 组(41.06±1.42)存活率降低(P0.05)。与 Ly294002+PD98059+A/R+CSWT 组(55.95±4.82)相比,Ly294002+A/R+CSWT 组(67.01±4.71)、PD98059+A/R+CSWT 组(77.29±1.55)细胞存活率增加(P 均0.05),Ly294002+PD98059+A/R 组(41.06±1.42)细胞存活率降低(P0.05)。PD98059+A/R+CSWT 组与 Ly294002+A/R+CSWT 组相比,细胞存活率增加(77.29±1.55vs67.01±4.71,P0.05)。2、流式细胞技术检测各组H9C2细胞凋亡率情况:A/R组与Control组比,细胞凋亡率增加(6.29±0.21vs3.08±0.26,P0.05)。与 A/R组(6.29±0.21)相比,LY294002+A/R 组(9.54±0.25)、PD98059+A/R 组(7.95±0.39)细胞凋亡率增加(P 均0.05),A/R+CSWT 组(3.83±0.46)凋亡率减少(P0.05)。与 A/R+CSWT组(3.83±0.46)相比,Ly294002+A/R+CSWT 组(5.83±0.29)、PD98059+A/R+CSWT组(4.72±0.26)细胞凋亡率增加(P 均0.05)。与 LY294002+A/R组(9.54±0.25)相比,Ly294002+PD98059+A/R 组(11.7±1.31)细胞凋亡率增加,PD98059+A/R组(7.95±0.39)细胞凋亡率减少(P 均0.05)。与 PD98059+A/R组(7.95±0.39)相比,Ly294002+PD98059+A/R组(11.7±1..31)细胞凋亡率增加(P0.05)。与Ly294002+PD98059+A/R+CSWT(6.82±0.47)相比,Ly294002+A/R+CSWT组(5.83±0.29)、PD98059+A/R+CS WT 组(4.72±0.26)细胞凋亡率减少(P 均0.05),Ly294002+PD98059+A/R 组(11.7±1.31)细胞凋亡率增加(P0.05)。PD98059+A/R+CSWT组与Ly294002+A/R+CSWT组相比,细胞凋亡率减少(4.72±0.26vs5.83±0.29,P0.05)。3、RT-PCR检测各组H9C2细胞抗凋亡基因Bcl-2、促调亡基因Bax和Casepase-3的mRNA转录情况示:与Control组相比,A/R组Bcl-2的mRNA转录水平降低(0.40±0.02 vs 1±0.00,P0.05),Bax 和 Caspase3 的 mRNA 转录水平升高(3.00±0.24 vs 1±0.00,1.89±0.16 vs 1±0.00,P 均0.05)。与 A/R 组相比,LY294002+ A/R 组、PD98059+A/R 组 Bcl-2 的 mRNA 转录水平降低(0.25±0.02 vs 0.40±0.02,0.30±0.01vs0.40±0.02,P 均0.05),Bax 和 Caspase3 的 mRNA 转录水平在上述组间比较结果与Bcl-2相反。A/R+CSWT组与A/R组相比,Bcl-2 mRNA 转录水平升高(0.85±0.01 vs 0.40±0.02,P0.05),Bax 和 Caspase3 的mRNA 转录水平降低(1.11±0.07 vs 3.00±0.24,1.07±0.09 vs 1.89±0.16,P均0.05)。与 A/R+CSWT 组相比,Ly294002+A/R+CSWT 组、PD98059+A/R+CSWT组 Bcl-2 的 mRNA 转录水平降低(0.53±0.08 vs 0.85±0.01,0.64±0.03 vs 0.85±0.01,P 均0.05),Bax 的 mRNA 转录水平升高(2.06±0.24 vs 1.11 ±0.07,1.47±0.15 vs 1.11±0.07,P 均0.05),且 Ly294002+A/R+CSWT 组 Caspase3 的 mRNA 转录水平也升高(1.74±0.16 vs 1.07±0.09,P0.05)。与 LY294002+A/R 组比,Ly294002+PD98059+A/R 组 Bcl-2 的 mRNA 转录水平降低(0.16±0.02 vs 0.25±0.02,P0.05),Bax 和 Caspase3的mRNA 转录水平升高(7.86±0.16 vs 5.40±0.05,5.71±0.25vs4.36±0.04,P 均0.05),而 PD98059+A/R 组 Bcl-2 的mRNA 转录水平升高(0.30±0.01 vs 0.25±0.02,P0.05),Bax 和 Caspase3 的mRNA 转录水平降低(3.84±0.17vs 5.40±0.05,3.06±0.26vs4.36±0.04,P均0.05)。与 PD98059+A/R 相比,Ly294002+PD98059+A/R 组 Bcl-2的mRNA 转录水平降低(0.16±0.02vs0.30±0.01,P0.05),而 Bax 和 Caspase3 的 mRNA转录水平升高(7.86±0.16vs3.84±0.17,5.71±0.25vs3.06±0.26,P 均0.05)。与Ly294002+PD98059+A/R+CSWT 相比,Ly294002+A/R+CSWT 组和 PD98059+A/R+CSWT 组 Bcl-2的mRNA 转录水平升高(0.53±0.08 vs 0.38±0.01,0.64±0.03 vs 0.38±0.01,P均0.05),而Bax和Caspase3的mRNA转录水平在上述组间比较结果与 Bcl-2 相反。Ly294002+PD98059+A/R 组与 Ly294002+PD98059 +A/R+CSWT 相比,Bcl-2 的 mRNA 转录水平降低(0.16±0.02 vs 0.38±0.01,P0.05),而 Bax 和 Caspase3 的 mRNA 转录水平升高(7.86±0.16 vs 2.97±0.40,5.71±0.25 vs 2.26±0.18,P 均0.05)。PD98059+A/R+CSWT 与 Ly294002+A/R+CSWT 比较Bcl-2mRNA 转录水平升高(0.64±0.03vs0.53±0.08,P0.05)、Bax 和 Caspase3的mRNA转录水平降低(1.47±0.15vs 2.06±0.24,1.20±0.16vs 1.74±0.16,P均0.05)。4、Western-blot检测各组细胞抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax、Casepase-3的表达情况示:与Control组相比,A/R组Bcl-2蛋白相对表达量明显减少(0.56±0.04 vs 1.54±0.09,P0.05),Bax 和 Caspase3 的相对表达量增加(0.54±0.04 vs 0.08±0.01,0.16±0.04vs0.06±0.01,P0.05)。与 A/R组相比,LY294002+A/R组和 PD98059+A/R 组 Bcl-2 相对表达量降低(0.15±0.01 vs 0.56±0.04,0.36±0.06 vs 0.56±0.04,P 均0.05),Bax 相对表达量增加(0.87±0.02vs0.54±0.04,0.68±0.03 vs0.54±0.04,P均0.05),且LY294002+A/R组Caspase3 的相对表达量也增加(0.27±0.03 vs 0.16±0.04,P0.05),A/R+CSWT 组 Bcl-2 相对表达量增加(0.84±0.06 vs 0.56±0.04,P0.05),而 Bax 和 Caspase3 的相对表达量降低(0.11±0.01vs0.54±0.04,0.07±0.01vs0.16±0.04,P 均0.05)。与 A/R+CSWT组比,Ly294002+A/R+CSWT组Bcl-2相对表达量明显降低(0.68±0.06 vs 0.84±0.06,P0.05)、Bax 及 Caspase3 相对表达量增加(0.21±0.03 vs0.11±0.01,0.14±0.02 vs 0.07±0.01,P 均0.05),PD98059 +A/R+CSWT 组 Bax 相对表达量明显增加(0.16±0.01 vs 0.11±0.01,P0.05)。与 LY294002+A/R 组比,Ly294002+PD98059+A/R 组Bcl-2 相对表达量降低(0.06±0.01 vs 0.15±0.01,P0.05)、同时 Bax 和 Caspase3 的相对表达量升高(1.11±0.02 vs 0.87±0.02,0.54±0.09vs0.27±0.03,P 均0.05),而 PD98059 + A/R 组 Bcl-2 相对表达量增加(0.36±0.06 vs 0.15±0.01,P0.05)、同时 Bax 和 Caspase3 的相对表达量降低(0.68±0.03 vs 0.87±0.02,0.20±0.02 vs 0.27±0.03,P 均0.05)。与PD98059+A/R 组相比,Ly294002+PD98059+A/R 组 Bcl-2 相对表达量降低(0.06±0.01 vs0.36±0.06,P0.05)、Bax和Caspase3的相对表达量加(1.11±0.02 vs 0.68±0.03,0.54±0.09 vs 0.20±0.02,P0.05)。与 Ly294002+PD98059+A/R+CSWT 相比,PD98059+A/R+CSWT 组 Bcl-2 相对表达量升高(0.85±0.05 vs 0.47±0.06,P0.05)、Bax 和 Caspase3 的相对表达量降低(0.16±0.01 vs 0.37±0.01,0.08±0.01vs0.17±0.03,P 均0.05),Ly294002+A/R+CSWT 组Bcl-2 相对表达量升高(0.68±0.06vs0.47±0.06,P0.05)、Bax 的相对表达量降低(0.21±0.03 vs 0.37±0.01,P0.05),Ly294002+ PD98059+ A/R 组 Bcl-2 相对表达量降低(0.06±0.01vs 0.47±0.06,P0.05)、Bax和Caspase3的相对表达量升高(1.11±0.02 vs 0.37±0.01,0.54±0.09 vs 0.17±0.03,P 均0.05)。PD98059+A/R+CSWT 与Ly294002+A/R+CSWT 比较 Bcl-2 的相对表达量升高(0.85±0.05 vs 0.68±0.06,P0.05)、Bax 和 Caspase3 的相对表达量降低(0.16±0.01 vs0.21±0.03,0.08±0.01 vs0.14±0.02,P 均0.05)。5、Western-blot检测各组细胞P-AKT、P-ERK蛋白表达情况:与Control组相比,A/R组P-AKT及P-ERK蛋白相对表达量明显降低(0.69±0.05 vs 0.98±1.05,0.27±0.03vs0.46±0.04,P均0.05),而 A/R+CSWT组与 A/R组相比,P-AKT及P-ERK蛋白表达明显增加(0.97±1.12vs 0.69±0.05,0.38±0.06vs 0.27±0.03,P均0.05)。与 A/R+CSW 相比,LY294002+A/R+CSWT 组 P-AKT 蛋白的相对表达量明显减少(0.72±0.82 vs 0.97±1.12,P0.05),PD98059 +A/R+CSWT 组 P-ERK蛋白的相对表达量明显减少(0.25±0.01 vs0.38±0.06,P0.05)。[结论]1、缺氧/复氧诱导H9C2细胞凋亡的发生,其通过抑制抗凋亡因子Bcl-2表达,促进促调亡因子Bax、Caspase-3表达来实现上述效应,提示缺氧/复氧可能是通过线粒体途径介导了 H9C2细胞凋亡的发生。2、PI3K/Akt信号通路和ERK1/2信号通路对H9C2细胞具有保护效应,能抑制缺氧/复氧诱导的H9C2细胞凋亡。3、CSWT预处理能激活PI3K/Akt信号通路和ERK1/2信号通路,调控其下游的凋亡相关因子的表达,抑制缺氧/复氧诱导的H9C2细胞凋亡。4、PI3K/Akt信号通路和ERK1/2信号通路在CSWT预处理抑制缺氧/复氧诱导的H9C2细胞凋亡的过程中存在协同作用,且以PI3K/Akt信号通路占主导地位。
【图文】：

逦昆明医科大学硕士研宄生学位论文逦逡逑结果逡逑１、缺氧／复氧损伤导致Ｈ９Ｃ２细胞形态学发生改变逡逑如图２示：正常培养的Ｈ９Ｃ２细胞，为贴壁细胞，呈梭形，细胞形态清晰完逡逑整。缺氧／复氧后的Ｈ９Ｃ２细胞边缘模糊不清，部分细胞变圆发亮，，细胞贴壁不良，逡逑甚至有部分凋亡细胞漂浮于培养基中。逡逑
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R54

【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 余红;朱锦云;王建安;;干细胞治疗缺血性心肌病研究进展[J];中国介入心脏病学杂志;2015年05期

2 张健;张宇辉;;多中心、前瞻性中国心力衰竭注册登记研究——病因、临床特点和治疗情况初步分析[J];中国循环杂志;2015年05期

3 周超;王静;庞玺倬;郭涛;;体外心脏震波治疗冠心病新进展[J];中国循环杂志;2015年03期

4 刘保逸;陈聪霞;张瑞生;李文婵;姚稚明;何青;;体外心脏震波系统治疗顽固性心绞痛的临床探讨[J];中国心血管杂志;2015年01期

5 杨萍;彭云珠;郭涛;王钰;蔡红雁;赵玲;;体外心脏震波治疗对冠心病患者血管再生相关细胞因子的影响[J];昆明医科大学学报;2014年05期

6 羊超;王钰;潘家华;郭涛;马铁昆;蔡红雁;陶四明;顾云;赵玲;肖践明;杨西云;;体外心脏震波治疗难治性冠心病的安全性研究[J];中国心血管杂志;2010年05期

7 孙帅;郭涛;;体外心脏震波治疗猪急性心肌梗死对血清内皮型一氧化氮合酶表达的影响[J];中国全科医学;2010年15期

8 闫凤霞;孙阁;张泓波;刘艳华;袁亚非;;细胞凋亡与缺血性心肌病[J];承德医学院学报;2006年02期

9 谢俊然,郁丽娜,段世明;心肌缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡的分子调节机制[J];国外医学.麻醉学与复苏分册;2005年04期

10 姚震,焦解歌,冯建章,翁阳,尹瑞兴,顾申红;心肌缺血-再灌注损伤与细胞凋亡关系的实验研究[J];海南医学院学报;2000年03期

相关博士学位论文 前1条

1 张云鹤;体外心脏震波治疗在大鼠急性心肌梗死心肌细胞凋亡中的作用和机制研究[D];北京协和医学院;2016年

相关硕士学位论文 前1条

1 西雁;体外冲击波治疗难治性心绞痛的初步疗效及安全性[D];复旦大学;2009年

本文编号：2628476