TLR4的激活调控BMP7对主动脉瓣膜间质细胞成骨分化的影响及机制研究

发布时间：2020-04-15 12:07

【摘要】：目的:探究TLR4的激活调控BMP7对主动脉瓣膜间质细胞成骨分化的影响及其分子机制,为钙化性主动脉瓣膜病(calcific aortic valve disease,CAVD)的早期干预及治疗提供理论依据。方法:非CAVD瓣膜组织(non-CAVD组)取自手术治疗的主动脉夹层患者,CAVD瓣膜组织(CAVD组)取自因钙化性主动脉瓣狭窄而进行瓣膜置换术的患者,采用免疫组化和Western blot实验检测non-CAVD组和CAVD组中炎症受体TLR4、骨形态发生蛋白7(BMP7)以及成骨指标Runx2、α-SMA的蛋白表达水平。猪主动脉瓣膜间质细胞(valve interstitial cells,VICs)选取健康家猪处死立即摘取主动脉瓣叶,分离VICs细胞,并采用免疫荧光染色行表型鉴定。采用脂多糖LPS激活VICs细胞TLR4炎症受体后,ALP染色和茜素红S染色实验检测细胞早期及晚期成骨分化能力;qPCR和Western blot实验验证BMP7表达的变化,检测细胞成骨相关基因及蛋白Runx2和OPN的表达情况。此外,猪VICs细胞在成骨培养基诱导下,感染Ad-BMP7腺病毒后,ALP染色和茜素红S染色实验分别检测其对VICs细胞早期及晚期成骨分化的影响;qPCR和Western blot实验检测炎症因子IL-6、IL-8及成骨相关基因及蛋白Runx2和OPN的表达情况。在LPS激活TLR4炎症受体后,采用脂质体转染法将BMP7-siRNA转染VICs细胞,ALP染色和茜素红S染色实验分别检测其对VICs细胞早期及晚期成骨分化的影响;Western blot实验验证细胞TLR4炎症受体、成骨相关指标Runx2、OPN的表达情况,检测非经典成骨信号通路AKT、ERK1/2和经典成骨信号通路Smad1/5/8的磷酸化水平,初步探讨其机制。在体内实验中,采用ApoE~(-/-)小鼠给予高脂饮食来构建CAVD钙化小鼠模型,超声心动图和HE染色验证模型是否构建成功,免疫组化法检测小鼠模型心脏瓣膜组织中TLR4、BMP7以及成骨特异性转录因子Runx2的表达情况。结果:在人瓣膜组织中TLR4、BMP7以及相关成骨标志物Runx2、α-SMA在CAVD组中表达明显高于non-CAVD组。成功分离出原代猪VICs细胞,免疫荧光染色显示α-SMA(+)、vimentin(+),vWF(-),细胞鉴定为猪主动脉瓣膜间质细胞。采用脂多糖LPS激活VICs细胞的TLR4炎症受体后,可上调BMP7表达,促进其早期及晚期成骨分化能力,上调Runx2、OPN的基因及蛋白表达;同时,磷酸化的Akt、ERK以及BMP-Smad1/5/8蛋白表达水平均明显增加。猪VICs细胞在成骨培养基诱导下,感染Ad-BMP7腺病毒后,促进VICs细胞早期及晚期成骨分化能力,促进瓣膜间质细胞的炎症反应以及Runx2、OPN的表达。在LPS激活TLR4炎症受体后,干扰BMP7抑制了细胞早期及晚期成骨分化能力,抑制成骨相关蛋白Runx2、OPN的表达,但干扰BMP7对TLR4炎症受体表达没有影响;仅磷酸化的Smad1/5/8蛋白水平明显降低,对磷酸化的AKT、ERK1/2蛋白表达水平没有影响。CAVD钙化小鼠模型构建成功,钙化小鼠模型心脏瓣膜组织中高表达TLR4,BMP7以及成骨特异性转录因子Runx2。结论:TLR4的激活可上调BMP7促进主动脉瓣膜间质细胞成骨分化,BMP7/Smads信号通路可能在该过程中发挥重要作用。
【图文】：

25图 1 TLR4、BMP7 以及相关成骨指标在钙化瓣膜组织中表达明显高于非钙化瓣膜组织Fig.1 The expression of TLR4, BMP7 and Osteogenic markers in CAVD group wassignificantly higher than that in non-CAVD group.（A）The expression of TLR4, BMP7 and Runx2 in CAVD group and non-CAVD group detectedby immunohistochemistry(×200,×400); (B)The expression of TLR4, BMP7, Runx2 and α-SMAdetected by Western Blot; (C) Semiquantitative analyses of B; **P<0.01,***P<0.001.2.2 原代猪主动脉瓣膜间质细胞的形态特征及表型鉴定接种 24h 后细胞贴壁，形态呈长梭形，放射状走行，见图 2（A）；细胞免疫荧光染色检测示，所培养细胞的细胞质中，间质细胞特异性蛋白标志物α-SMA阳性表达,见图 2（B）；vimentin 阳性表达，见图 2（C）；而内皮细胞特异性标志物 vWF 无表达，，见图 2（D）。结果提示，细胞鉴定为主动脉瓣膜间质细胞。

图 2 猪主动脉瓣膜间质细胞形态及表型鉴定 Morphological and phenotypic characterization of porcine aortic valve interstitiLight microscopy image(×100) of VICs （;B）Immunofluorescence staining of α-SMAImmunofluorescence staining of Vimentin(×200)（;D）Immunofluorescence staining 0)TLR4 炎症受体的激活诱导 BMP7 的表达上调，促进瓣膜间胞的成骨反应常规完全培养基培养瓣膜间质细胞至融合度约 50%，分别采用不同浓（0、2、4、6、8、10μg/ml）处理细胞 24h 后，qPCR 法检测炎症指标 T 和 IL-8 的表达情况，筛选出最适 LPS 浓度为 4μg/ml,后续实验均采用见图 3（A）；在诱导 VICs 细胞成骨分化时，加入 LPS 处理细胞 7d 后结果显示，与对照组相比，LPS 处理组 ALP 染色明显增加，见图 3（
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R542.52

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本文编号：2628533