ROS在铁过载引起的MDS患者红系及MSCs凋亡中的作用及相关机制的研究

发布时间：2020-04-17 01:17

【摘要】：目的:评估ROS在IO引起的MDS/AML/MSCs损伤中的作用,探索HIF-1a/ROS信号通路在IO引起的MDS患者红系凋亡中的作用及AMPK/MFF/Drp1信号通路在IO引起的MDS-MSCs凋亡中的作用。方法:(1)采用FAC在MDS/AML/MSCs中建立体外IO模型,流式确定MDS/AML/MSCs内LIP和ROS水平。IO条件下检测MDS/AML/MSCs凋亡、周期及增殖情况。使用DFO、NAC或Catalase处理IO的MDS/AML/MSCs,评估ROS在IO引起的MDS/AML/MSCs功能改变中的作用。(2)利用Western blotting检测IO条件下MDS/AML细胞内HIF-1a蛋白的表达水平。构建HIF-1a干扰和过表达慢病毒,分别转染MDS/AML细胞,检测HIF-1a下调或上调后MDS/AML细胞内ROS水平。IO条件下,MDS/AML细胞分别转染HIF-1a过表达慢病毒,检测MDS/AML细胞ROS、凋亡、增殖及周期情况,确定HIF-1a在IO引起的MDS/AML细胞功能改变中的作用。分离培养MDS患者BMMNCs,检测CD235a+红系的ROS、凋亡及HIF-1a蛋白水平,确定IO条件下HIF-1a/ROS信号通路在MDS患者红系凋亡中的作用。(3)分离培养MDS-MSCs,IO条件下检测正常MSCs和MDS-MSCs内线粒体形态、自噬水平、ATP浓度、ETC复合物I/II/III活性及MSCs凋亡、增殖情况。采用DFO、NAC或Catalase处理IO的MSCs,评估ROS在IO引起的MSCs功能改变中的作用。IO条件下,Western blotting检测正常MSCs内AMPK/MFF/Drp1信号通路相关蛋白的表达情况。构建AMPK CRISP/Cas9和MFF shRNA慢病毒,并转染正常MSCs,确定AMPK/MFF/Drp1信号通路在IO引起的MSCs功能变化中的作用。采用DFO、NAC或Catalase处理IO的MDS-MSCs,Western blotting评价AMPK信号通路下游蛋白的表达情况,确定AMPK/MFF/Drp1信号通路在IO引起的MDS-MSCs损伤中的作用。结果:(1)经检测,FAC能增加MDS/AML/MSCs内LIP和ROS水平,同时使MDS/AML/MSCs凋亡增加、增殖减弱及周期阻滞。采用DFO、NAC或Catalase处理IO的MDS/AML/MSCs,使MDS/AML/MSCs内ROS水平降低,且凋亡增加、增殖减弱及周期阻滞均得到改善。说明IO可通过增加MDS/AML/MSCs内ROS水平损伤MDS/AML/MSCs功能。(2)下调或上调MDS/AML细胞内HIF-1a水平后,MDS/AML细胞内ROS水平上调或下调。IO可使MDS/AML细胞内HIF-1a蛋白表达降低,当IO条件下上调MDS/AML细胞内HIF-1a的水平,ROS水平降低且MDS/AML细胞凋亡增加、增殖减弱及周期阻滞均得到改善。更重要的是,HIF-1a/ROS信号通路参与IO引起的MDS患者红系凋亡。(3)正常MSCs内,IO通过增加ROS水平和抑制ETC复合物II/III活性降低MSCs内ATP浓度,激活了AMPK/MFF/Drp1信号通路,引起MSCs内线粒体碎片化、自噬增加、凋亡增加和增殖减弱。MDS-MSCs内,我们也发现IO通过增加ROS水平,导致MDS-MSCs内ATP浓度降低、凋亡增加及增殖减弱,同时线粒体碎片化和自噬增加。更重要的是,IO能够激活MDS-MSCs内AMPK通路。说明AMPK/MFF/Drp1信号通路在IO引起的MDS-MSCs损伤中具有重要作用。结论:IO通过增加ROS水平引起MDS/AML/MSCs凋亡增加、增殖减弱和周期阻滞;IO条件下,MDS患者红系中HIF-1a表达降低,引起ROS表达增加,促进MDS患者红系凋亡;IO条件下,MDS-MSCs内高水平ROS激活的AMPK/MFF/Drp1信号通路在MDS-MSCs线粒体损伤和细胞凋亡中具有重要作用。
【图文】：

图 1. MDS/AML/MSCs 细胞体外 IO 模型的建立SKM-1 细胞（A）、K562 细胞（B）和 HS-27a 细胞（C）分别采用不同浓度 FAC 处理，在不同时间点（1h、6h、12h、24h 和 48h）收集细胞，，用 CA-AM 标记，采用流式检测三种细胞内铁离子含量。高铁状态下的 SKM-1 细胞（D）、K562 细胞（E）和 HS-27a 细胞（F）分别采用不同浓度 DFO 处理，在不同时间点（1h、6h、12h、24h 和 48h）收集细胞，用 CA-AM标记，采用流式检测三种细胞内铁离子含量。Figure 1. IO models were established in MDS/AML/MSCs in vitroSKM-1 (A) / K562 (B) / HS-27a (C) cells were treated with different concentrations of FAC for 1h,6h, 12h, 24h and 48h, then cellular iron content was detected by flow cytometry with CA-AMstaining. SKM-1 (D) / K562 (E) / HS-27a (F) cells in high iron state were treated with differentconcentrations of DFO for 1h, 6h, 12h, 24h and 48h, then cellular iron content was detected byflow cytometry with CA-AM staining.2. IO 增加 MDS/AML/MSCs 细胞内 ROS 水平

上海交通大学博士学位论文uM）/MSCs（0uM、10 uM、100 uM、1000 uM）细胞培养基中作用 1h、6h、12h、24 和 48h 后细胞内 ROS 的水平。结果显示随着 MDS/AML/MSCs 细胞内铁离子浓度的增加及作用时间的延长，MDS/AML/MSCs 细胞内 ROS 水平逐渐增加（图2A-C）。同时结果还显示 DFO 在降低 MDS/AML/MSCs 细胞内铁离子浓度的同时也有效的降低了 ROS 水平（图 2D-F）。上述结果表明 IO 能够增加MDS/AML/MSCs 细胞内 ROS 水平。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R551.3

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本文编号：2630269