脊髓电刺激治疗心房颤动实验犬疗效及机制的研究

发布时间：2020-04-28 01:23

【摘要】：[背景]心房颤动(AtrialFibrillation,AF)是临床上最常见的心律失常,已逐渐成为一种心血管流行病,具有较高的发病率及病死、病残率,其疾病本身及其并发症,严重威胁人们健康。多项研究提示,自主神经张力失衡引发心脏电-解剖重构,在AF的发生和维持中扮演重要角色,参与了房颤的发生与维持。脊髓电刺激(Spinal Cord Stimulation,SCS)治疗可通过向特定脊髓节段发放低能量、高频率的电刺激,调控机体自主神经活性与自主神经张力的平衡,提示干预自主神经系统的活性与张力可治疗心房颤动,已有以内在自主神经(ICN)为靶点的治疗心房颤动的方法,但具有一定的局限性。通过干预外在自主神经(ECN)的方式,向外在自主神经所在的特定脊髓节段释放能量进行电刺激来治疗心房颤动具有巨大的潜力与前景。[目的]通过对比格犬心房颤动模型实施脊髓电刺激治疗,观察脊髓电刺激治疗对治疗心房颤动的可行性及治疗效果,深入探讨其方法学及可能的显效机制,为探索心房颤动的治疗新策略,开拓新的治疗靶点提供科学依据。[方法]1.选取18只成年比格犬,雌雄不拘,随机分为空白对照组(Ctrl组,6只),不接受脊髓电刺激的心房颤动模型组(AF组,6只),接受脊髓电刺激的心房颤动模型组(SCS组,6只)。进行犬心房颤动模型的建立及脊髓电刺激治疗心房颤动犬的研究。(1)运用Medtronic公司研发的SelectSecure系统,植入目前最细的双极实心电极导线-3830主动固定电极,连接专用房颤模型起搏器建立心房起搏系统。术后采用AOO起搏模式下的快速心房起搏的方法建立心房颤动模型。术前及术后每周描记标准肢体导联心电图,同时运用植入式心电监测器Reveal LINQ追踪器实时追踪房颤的发生。(2)在SCS组,借助成熟的腰穿技术,经实验犬L2-L3腰椎间隙以小于45度进行穿刺,植入标准间距8触点经皮穿刺电极导线,连接脊髓刺激器,建立脊髓电刺激系统。在脊髓电刺激期间,运用植入式心电监测器Reveal LINQ追踪器实时监测治疗期间的房颤负荷。(3)AF组实验犬在术前、房颤模型成功建立后、处死前进行超声心动图检查;SCS组实验犬在术前、房颤模型成功建立后、脊髓电刺激达到治疗疗程后、处死前进行超声心动图的检查;Ctrl组实验犬均进行同期超声心动图检查,经心尖四腔测量左、右心房收缩末期心房面积。(4)运用CARTO系统对心脏进行三维建模标测,将心内电生理信息与心腔内空间解剖结构结合起来。在对双心房建模标测的过程中,创新性地在无X射线的情况下,成功穿刺股静脉,经鞘管置入PentaRay高精密度标测导管,构建右心房和上下腔静脉三维模型;于胸部左侧第四至第五肋间,作一长约3厘米横行切口,在胸廓撑开器辅助下暴露心脏,纵向剪开心包,暴露左心耳。直视下穿刺心耳尖,经鞘管植入PentaRay高精密度标测导管,快速建立左心房体部,肺静脉前庭部和左心耳三维模型,并进行电生理指标的测定。(5)处死实验犬。处死前采集血液标本,离心后储存备检。处死实验犬后,取出心脏后,分离采集左心房组织。分别进行光镜、电镜、免疫组化及左心房组织转录组学的相关研究。2.采用Label free蛋白质非标记定量技术分析AF组、SCS组及Ctrl组实验犬血清标本中差异蛋白的表达量。通过生物信息学的分析,使用聚类分析对表达有差异的蛋白进行聚类分析、GO分析、蛋白互作分析等。对三组间进行差异蛋白的选择,并运用ELISA进行验证部分研究相关的差异蛋白的表达量,初筛在SCS干预AF过程中,具有指导意义、可发挥关键作用的的生物标记蛋白。3.对AF组、SCS组及Ctrl组实验犬左心房肌组织采用转录组测序的方法,通过对整体基因表达水平进行分析,对三组间具有表达差异的基因进行筛选,挑选出差异基因,应用生物信息学分析方法对差异表达基因进行GO分析、KEGG通路注释及富集分析,找出差异基因显著富集的GO和KEGG条目。运用qRT-PCR对部分差异基因进行定量分析,并采用Western blot方法对部分差异表达基因的蛋白表达水平进行验证。[结果]1.(1)18只实验犬中,共有15只实验犬完成实验,其余3只在建模过程中死亡。在建立房颤模型过程中,建立房颤模型总成功率为100%。成功建立房颤模型的时间为10.63±2.13(周);房颤模型建立成功时,在AOO模式下,高频房颤模型起搏器心房刺激频率为588.75±11.26(次/分)。运用植入心电监测器Reveal LINQ动态追踪记录AF组与SCS组房颤负荷。用以监测心房颤动的发生与SCS治疗后房颤的负荷变化,SCS组实验犬的房颤负荷明显低于AF组实验犬(7.34±2.34%vs.46.43±5.16%,P0.001)。(2)采用美国GE Vividq心脏彩色超声显像仪,探头发射频率2.5MHZ对实验犬进行超声心动图的检查。房颤模型制作成功后,左心房面积较建模前显著增大(8.20±0.83cm2vs.3.80±0.08cm2,p0.05);右房面积较建模前增大(4.52±0.44cm2vs.2.75±0.96cm2,p0.05)。三组间进行左心房面积与右心房面积的比较,SCS组左房面积较AF组减小(5.04±0.89cm2 vs.8.20±0.83cm2,P0.05),右房面积较 AF 组减小(4.20±0.13 cm2 vs.4.52±0.44cm2,p0.05);AF组左房面积较 Ctrl 组增大(8.20±0.83cm2vs.3.72±0.15cm2,p0.05);右房面积较 Ctrl 组增大(4.52±0.44cm2 vs.2.78±0.18cm2,p0.05);SCS 组左房面积较Ctrl 组增大(5.04±0.89cm2vs.3.72±0.15cm2,p0.05),右房面积较 Ctrl 组增大(4.20±0.13cm2 vs.2.78±0.18cm2,p0.05)(3)进行电生理检测,对三个组的实验犬均进行电生理检查,测试左、右心房有效不应期,AF组与Ctrl组相比,AF组左心房有效不应期缩短(101.33±5.79ms vs.117.67±6.84ms,P0.05),右心房有效不应期缩短(95.78±11.05ms vs.117.78±10.20ms,P0.05);SCS组与AF组相比,SCS组左心房有效不应期延长,(106.33±5.61msvs.101.33±5.79,P0.05),差异不具有统计学意义;右心房有效不应期延长,(101.44±9.26msvs.95.78±11.05ms,P0.05),差异不具有统计学意义;SCS组与Ctrl组相比,SCS组左心房有效不应期缩短(106.33±5.61ms vs.117.67±6.84ms,0.05),右心房有效不应期缩短(101.44±9.26ms vs.117.78±10.20ms,P0.05)。(4)对左心房心肌进行光镜观察,结果提示在HE染色切片上,Ctrl组中左心房心肌细胞结构完整,排列整齐,细胞核清晰,规则的纤维网填充与整个心肌细胞;间质内成纤维细胞形状规则数量适中。AF组中,心肌细胞增大,排列紊乱,细胞核大小不规则,核出现异型改变,部分细胞出现明显坏死,空泡变性及颗粒样变性,细胞间质疏松,出现心肌纤维化,有炎症细胞的浸润。SCS组中,心肌细胞完整,排列稍不整,胞核有部分异型改变,细胞溶解坏死较AF组减少,细胞间质疏松,有部分心肌纤维化改变,但较AF组稍减少。对左心房心肌进行电镜观察,结果提示Ctrl组左心房肌细胞的肌原纤维节的排列是有序的,核膜内染色质结构表现为正常;AF组左心房肌细胞超微结构明显异常,肌原纤维节出现了严重的退化,细胞核出现严重的固缩的现象,同时还可见有细胞的凋亡,内质网出现肿大征象,伴随着部分肌丝的崩解,肌纤维表现出杂乱无序。SCS组心肌细胞有超微结构的异常征象,但无AF组表现显著,肌原纤维节可见一定程度的退化,但仍能看到大部分肌原纤维节排列整齐,部分细胞出现核固缩,内质网肿胀,糖原增多,仍可见部分排列紧致的肌纤维。2.采用Label free蛋白质非标记定量技术方法在三组实验犬中,共可定量蛋白数349个。其中AF组与Control组差异蛋白数为18个,SCS组与Control组差异蛋白数为16个,SCS组与AF组差异蛋白数为23个。通过生物信息学的分析,对差异表达蛋白进行聚类分析、GO分析、蛋白互作分析等。通过对部分差异蛋白KNG1、CFP、C1R、SERPINA4并运用ELISA进行验证,提示这四个差异蛋白在组间具有差异性,结果显示:(1)在SCS组中,KNG1的表达量高于Ctrl组与AF组,在AF组中KNG1的表达量高于Ctrl组,组间有差异;(2)CFP的表达量在AF组显著高于Ctrl和SCS组,Ctrl和SCS组表达无显著差异;(3)SCS组中,C1R的表达量显著低于AF组,同时也显著低于Ctrl组,而AF组与Ctrl组间在C1R的表达量无显著差异;(4)SERPINA4表达情况是SCS组的表达量显著高于Ctrl和AF组。蛋白的表达变化趋势与Lable free结果一致。3.对AF组、SCS组及Ctrl组实验犬心房肌组织采用转录组测序的方法,通过对整体基因表达水平进行分析,对组间具有表达差异的基因进行筛选,挑选出部分差异基因,其中表达上调的基因有MGST、MTMR2、EPHX2、INPP5、AMACR、ACOX2、IP6K3、ITPKC 和 PTGS2,表达下调的基因有 COL21A1、COL6A6、CRY2、SPP1、TFRC、SLC8A3、PER1、KCNJ8、MYLK3;通过聚类分析,对差异表达的基因进行聚类,并对差异基因的进行GO功能分析,对差异表达基因进行KEGG数据库中Pathway的功能注释和归类,根据KEGG显效的通路机制中可能与Peroxisome,Primary bile acid biosythesis信号通路相关。运用实时荧光定量核酸扩增检测系统(qRT-PCR)对选出的差异基因进行定量分析,提示差异基因的表达趋势与测序结果大致一致,并采用Western blot方法验证其中部分差异表达基因的蛋白表达水平。INPP5B在AF组的表达量显著高于Ctrl组与SCS组,SCS组表达量较AF组显著下调,KCNJ8在AF组表达量显著高于Ctrl组与SCS组,SCS组表达量较AF组显著下调,MGST表达量在AF组高于Ctrl组与SCS组,SCS组表达量较AF组、Ctrl组显著下调,IP6K3在AF组显著低于Ctrl组及SCS组,SCS组表达量显著高于Ctrl组与AF组。[结论]1.运用快速心房起搏可成功建立稳定的心房颤动模型。运用SelectSecure系统,植入3830双极实心心房起搏电极,这一方法可精准植入电极并提高在实验犬中电极植入成功率。运用植入式心电监测器(Reveal LINQ)实时动态监测房颤负荷,可提高实验监测效率。2.通过运用SCS干预心房颤动实验犬,是安全、可行、有效的,可减缓左心房的重构,对心房颤动导致的心房重构具有改善作用。3.通过运用Label free定量蛋白质组学初筛在SCS干预AF过程中差异表达蛋白,KNG1、CFP、C1R、SERPINA4等差异表达的蛋白与该干预过程可能具有相关性。本研究初筛具有指导意义、可发挥关键作用的差异蛋白,有望后续通过深入研究更精准地获得敏感性高、特异性好的生物标记蛋白,为更长远的临床工作提供动态监测预后,开拓新靶点的研究依据。4.通过转录组测序筛选出在SCS干预AF实验犬过程中,存在多个差异表达基因,可能与SCS治疗AF的治疗疗效具有相关性,为后续深入研究奠定基础,具有指导意义,可提供更多新的切入点。5.Peroxisome信号通路及Primary bile acid biosynthesis信号通路可能在SCS治疗AF实验犬的显效机制中具有重要的调控作用,可为后续深入的机制研究提供新的思路。
【图文】：

图２逦部分实验所用材料逡逑．．

颈外静脉,右心房,起搏器,预防感染

参数满意后撤出鞘管并固定电极导线；将电极与起搏器连接，将埋藏式高频逡逑率（频率９０？８１０次／ｍｉｎ）房颤模型起搏器（中国秦明）埋藏于颈前外侧的囊袋内逡逑（图２）。确认生命体征正常后，术后注射青霉素８０万Ｕ三天，预防感染。逡逑２４逡逑
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R541.75

【参考文献】