【摘要】：第一部分ASC-J9对实验性自身免疫性心肌炎中抗炎因子表达的影响研究背景心肌炎是指由多种原因引起的心肌局限性或弥漫性炎症病变,可导致心肌收缩和舒张功能减低、心律失常等。临床表现多样,病情轻重不一,轻者预后尚可,重者可出现严重心律失常、急性心力衰竭,甚至猝死。其病因包括感染、自身免疫性、毒物/药物性3类。其中,病毒性心肌炎是临床上最常见的病理类型。实验性自身免疫性心肌炎(Experimental autoimmune myocarditis,EAM)是由心肌自身抗体介导的心肌炎症反应,机体固有免疫和获得性免疫应答均参与其心肌炎症反应过程,这与病毒性心肌炎类似,因而是实验中模拟心肌炎炎症过程的常用模型。研究证实,心肌炎存在明显的性别差异,男性心肌炎患者较女性而言,其发病率高,病情更为严重。目前认为雄激素及其受体是影响这种性别差异的主要原因。机体内雄激素一般情况下需要与其受体——雄激素受体(androgen receptor,AR)结合,以发挥其生物学效应。AR是核转录因子,可存在于心肌组织及免疫系统的多种细胞,通过调节靶基因的转录参与免疫反应调节,从而在多种心血管疾病的发生、发展中发挥重要作用。我们前期研究表明,EAM小鼠心肌组织中AR表达与心肌的炎症反应状态有关,心肌炎症越严重,AR表达增加越明显。AR可以通过促进心肌组织中巨噬细胞向M1型极化而加重心肌的炎症损伤。ASC-J9是AR的特异降解剂,可降解全长及/或突变的AR,致使其失去生物学效应。研究表明,ASC-J9可通过调节巨噬细胞迁徙发挥抗炎作用,而不改变体内雄激素(主要是睾酮)水平。我们前期研究发现,经ASC-J9处理的EAM小鼠,心肌组织中IL-6、TNF-α、IL-1β及IL-17A等促炎因子都明显减低,表明ASC-J9可减少EAM小鼠心肌组织促炎因子的产生,从而减轻心肌的炎症反应。同时,ASC-J9可通过抑制EAM小鼠心肌组织中巨噬细胞向M1型极化从而缓解心肌炎症反应。心肌炎症反应过程中,各种抗炎细胞及抗炎因子亦参与其中。IL-10和IL-35分别是M2型巨噬细胞及T-reg细胞分泌的主要抗炎因子,其在心肌炎症损伤中具有保护作用。目前ASC-J9对EAM小鼠心肌组织中抗炎因子表达的影响仍不清楚。本实验将通过构建EAM小鼠模型,研究ASC-J9对实验性自身免疫性心肌炎中抗炎因子的表达及炎症的影响。研究目的构建EAM动物模型,研究AR特异降解剂ASC-J9对EAM小鼠心肌组织抗炎因子表达及炎症反应的影响。研究方法1.动物模型的建立与分组将体重18-20g的雄性Balb/c小鼠随机分为四组,具体分组如下:对照组、EAM组、EAM+DMSO(予0.5%DMSO作为溶剂对照组)、EAM+ASC-J9处理组。其中,①EAM组:在第0天、第7天腹腔注射小鼠心脏α肌球蛋白重链多肽(MyHC-α614-629),诱导自身免疫应答,作为EAM小鼠模型组;②EAM+ASC-J9处理组:从第8天开始,隔天于EAM小鼠腹腔注射雄激素受体降解剂ASC-J9,用以降解体内AR,至第20天为止。③EAM +溶剂对照组:作为ASC-J9处理组平行对照,在与ASC-J9处理组同一时间,于EAM小鼠腹腔注射等量含0.5%DMSO的生理盐水。本实验以21天作观察终点,获得相应实验动物模型。2.EAM模型的鉴定将对照组与EAM组小鼠进行对比,观察其心脏外观变化,并精确测量两组小鼠心脏质量/体重比值(HW/BW),以及脾脏总的单个核细胞数的变化情况。应用HE染色和Masson染色方法比较EAM组与对照组心脏组织炎症及纤维化情况。3.ASC-J9处理后心肌炎症情况将EAM+DMSO溶剂对照组与ASC-J9处理组小鼠进行对比,观察其心脏外观变化,同时精确计算两组小鼠心脏质量/体重比值(HW/BW),以及脾脏总的单个核细胞数的变化情况;用HE染色法检测两组小鼠心肌组织炎症细胞的侵润程度,并进行炎症评分;Masson染色比较两组小鼠心肌纤维化及胶原沉积情况。4.ASC-J9对抗炎因子表达的影响用QRT-PCR技术检测各组小鼠心肌组织中抗炎因子IL-10、IL-35的表达情况。研究结果1.心肌炎模型的判断:(1)EAM组小鼠与对照组相比较,其心脏外观略有发白,体积显著变大。EAM小鼠HW/BW较对照组显著增加(P0.001),脾脏中总的单个核细胞数量明显增多(P0.001);(2)心肌组织切片HE染色显示,EAM小鼠的心肌组织中炎症侵润程度明显增加;(3)组织切片Masson染色结果显示,与对照组比较,EAM小鼠心肌组织中的纤维化程度加重,胶原沉积明显增多。2.ASC-J9可明显减轻EAM小鼠心肌炎症:(1)与EAM+DMAO溶剂对照组相比,经ASC-J9处理后,EAM小鼠心脏体积缩小,HW/BW明显降低(P0.01),脾脏中总的单个核细胞数量显著减少(P0.001);(2)对各组小鼠的心肌组织石蜡切片行HE染色,结果显示,EAM+ASC-J9处理组小鼠心肌组织的炎性细胞侵润程度减轻,炎症评分显著降低(P0.01);(3)Masson染色显示ASC-J9处理后小鼠心肌组织中的纤维化程度及胶原沉积明显减轻(P0.005)。3.ASC-J9增加抗炎因子表达:QRT-PCR检测心肌组织中抗炎因子的表达,结果显示,较EAM+溶剂对照组,ASC-J9处理组IL-10(P0.01)及IL-35(P0.05)的表达明显增加。结论雄激素受体特异降解剂ASC-J9可以增加EAM小鼠心肌组织中抗炎因子IL-10及IL-35的表达,减轻EAM小鼠心脏的炎症反应。因此,ASC-J9有可能成为男性心肌炎患者治疗的新选择。第二部分ASC-J9对EAM小鼠巨噬细胞向M2表型分化的影响研究背景巨噬细胞是炎症性心血管疾病的重要介质,多个研究显示,巨噬细胞在心肌炎的炎症反应中起重要作用。巨噬细胞具有多样性和异质性,根据激活方式的不同,可极化成不同的表型,即M1型(经典活化型巨噬细胞)和M2型(选择活化型巨噬细胞),不同表型的巨噬细胞可能发挥相反的作用。研究显示,巨噬细胞的极化在心肌炎中具有重要作用。在心肌炎模型的心肌组织中M1型巨噬细胞大量聚集,通过抗原提呈及分泌促炎因子等,加重心肌炎症反应;而M2型巨噬细胞则作用相反,其具有抗炎、参与组织的修复的作用,增加心肌中M2型巨噬细胞极化可明显改善心肌炎。因此,调节巨噬细胞的极化可能成为治疗心肌炎的新靶点。我们前期研究结果显示,AR可促进EAM小鼠心肌组织中M1型巨噬细胞的极化,从而使心肌的炎症反应加重。而AR特异性降解剂ASC-J9可减少EAM小鼠心肌组织中巨噬细胞向M1型分化,进而改善EAM。但是M2型巨噬细胞作为抗炎细胞是否在这一过程中发挥作用仍不清楚,ASC-J9是否可调节巨噬细胞向M2型极化,从而减轻心肌炎的炎症反应,有待进一步研究。研究目的从动物实验及体外实验两方面,研究ASC-J9对实验性自身免疫性心肌炎小鼠巨噬细胞向M2表型分化的影响。研究方法1.动物实验1.1动物模型的建立与分组:随机将雄性Balb/c小鼠分为如下三组:对照组、EAM+ASC-J9处理组、及EAM+DMSO组(溶剂对照组,应用0.5%DMSO)。首先,使用MyHC-α614-629诱导小鼠自身免疫应答,构建EAM模型。然后,EAM+ASC-J9处理组小鼠在第8、10、12、14、16、18、20天,于腹腔及腋下注射ASC-J9降解AR。而作为平行对照组,EAM+DMSO组在与ASC-J9处理组相同时间点,于EAM小鼠腹腔注射等量含0.5%DMSO的生理盐水。以21天为观察终点,获取相应实验动物模型。1.2用免疫荧光染色技术,对各组小鼠心肌组织石蜡切片行F4/80和Arg-1双标染色,观察各组小鼠心肌组织中M2型巨噬细胞(F4/80+/Arg-1+)所占的百分比。1.3用QRT-PCR方法检测心肌组织中M2型巨噬细胞特异性标记物Arg-1、MMR的表达情况。2.体外实验2.1细胞培养及分组:将Balb/c小鼠巨噬细胞系(Raw264.7细胞)给予含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养。分为四组:1)空白组、2)IL-4处理组、3)IL-4+DMSO组(DMSO浓度为0.0005%,作为溶剂对照组)、4)1L-4+ASC-J9组。其中,ASC-J9处理组及DMSO组分别给予适量、适合浓度的ASC-J9和DMSO预处理,CO2培养箱恒温培养2小时,之后再加入IL-4进行刺激48小时,诱导M2型巨噬细胞极化。2.2应用QRT-PCR技术检测各组细胞中M2型巨噬细胞特异性标记物Arg-1、MMR的表达情况;2.3应用QRT-PCR检测各组细胞中M2型巨噬细胞分泌的细胞因子IL-10的表达情况;研究结果1.动物实验:ASC-J9处理增加EAM小鼠心肌组织中M2型巨噬细胞1.1 EAM小鼠心肌组织中M2比例的变化:免疫荧光双染色结果显示,与DMSO溶剂对照组相比较,EAM小鼠经ASC-J9处理后,其心肌组织中F4/80+/Arg-1+双阳性的M2型巨噬细胞占比例增加,但未达明显统计学意义(P=0.053);1.2 M2特异性标志物Arg-1及MMR表达的变化:进一步应用QRT-PCR检测发现,与DMSO溶剂对照组比较,EAM小鼠经ASC-J9处理后,其心肌组织中M2特异性标志物Arg-1(P0.01)及MMR(P0.05)均显著增加。2.体外实验:ASC-J9促进Raw264.7细胞向M2表型分化2.1 ASC-J9对M2特异性标志物Arg-1及MMR表达的影响:通过QRT-PCR检测发现,IL-4处理组与空白组对照,Arg-1(P0.001)及MMR(P0.001)的表达显著增加,表明刺激诱导成功;而ASC-J9处理的Raw264.7细胞中Arg-1(P0.01)及MMR(P0.05)的表达较溶剂对照组亦明显增加,表明ASC-J9促进Raw264.7细胞向M2表型分化。2.2 ASC-J9对M2分泌的抗炎因子IL-10的影响:IL-4处理组与空白组对照,IL-10的表达显著增加(P0.001),表明刺激诱导成功;与溶剂对照组相比,ASC-J9处理的Raw264.7细胞中IL-10表达亦明显增加(P0.05)。结论雄激素受体降解剂ASC-J9可以促进EAM小鼠中巨噬细胞向M2表型极化,增加M2型巨噬细胞分泌的抑炎因子,发挥抗炎作用,减轻心肌炎症反应,改善EAM。第三部分ASC-J9调节巨噬细胞向M2型极化的机制研究研究背景巨噬细胞具有异质性和功能可塑性的特点,研究表明,巨噬细胞可在IL-4、IL-13或IL-10等细胞因子的刺激下极化为M2型巨噬细胞。参与诱导M2型巨噬细胞极化的分子机制有多种,已证实激活JAK/STAT信号通路可以诱导巨噬细胞向M2表型极化。细胞因子信号抑制因子(Suppressors of cytokine signaling,SOCS)是一类可诱导的负反馈调节蛋白,由SOCS1-SOCS7和CIS组成,SOCS1-3可抑制JAK/STAT信号通路,从而调节机体固有免疫和适应性免疫应答反应。SOCS家族已证实是调节巨噬细胞极化的重要因子。目前已有研究表明,激活JAK1/STAT3/SOCS3信号通路可调解巨噬细胞向M2型极化,SOCS3表达减少及STAT3磷酸化增强与M2型巨噬细胞极化相关。我们通过转录因子预测系统PROMO数据库预测,发现雄激素受体(AR)可与SOCS3的启动子区结合。另外,通过第一部分及第二部分的研究,我们已证实,ASC-J9可通过降解AR增加IL-10的表达,而抑制SOCS3可反馈激活IL-10/STAT3信号通路促进M2型巨噬细胞极化。由此,我们推测ACS-J9可能通过STAT3/SOCS3通路调节M2型巨噬细胞的极化,但目前尚无相关研究报道。研究目的通过对EAM小鼠及巨噬细胞系应用ASC-J9处理,进一步研究ASC-J9促进巨噬细胞向M2型极化的机制。研究方法1.体内实验:将雄性Balb/c小鼠随机分为对照组、EAM+DSMO(予0.5%DMSO作为溶剂对照)组及EAM+ASC-J9处理组。应用MyHC-αO614_629免疫小鼠构建EAM模型。从免疫第8天开始,隔天向EAM模型小鼠腹腔注射ASC-J9或相同体积的含0.5%DMSO的生理盐水,第20天止,作为EAM+ASC-J9处理组及EAM+溶剂对照组。21天后处死实验小鼠,应用QRT-PCR技术检测各组小鼠心肌组织中M2型巨噬细胞极化相关因子SOCS3的表达情况;2.体外实验:将Raw264.7细胞(Balb/c小鼠巨噬细胞系)分为四组:1)空白组、2)1L-4处理组、3)1L4+DMSO组(DMSO浓度0.0005%,溶剂对照)、4)1L-4+ASC-J9处理组。其中,ASC-J9处理组及DMSO组分别给予适合浓度的ASC-J9和DMSO预处理2小时,然后再使用IL-4进行M2型巨噬细胞诱导极化培养。应用Western Blot技术检测IL-4刺激后各组细胞中和M2巨噬细胞极化相关因子SOCS3、STAT3的表达、活化情况。研究结果1.ASC-J9抑制EAM小鼠体内SOCS3的表达:应用QRT-PCR技术检测发现,ASC-J9处理组与DMSO溶剂对照组比较,其小鼠心肌组织中M2型巨噬细胞极化相关的抑制因子SOCS3的表达明显减少(P0.01);2.ASC-J9抑制培养细胞中SOCS3的表达、增加STAT3的磷酸化水平:应用Western Blot技术检测发现,与溶剂对照相比,ASC-J9处理组Raw264.7细胞中与M2型巨噬细胞极化相关的抑制因子SOCS3的表达明显减少(P0.05);同时STAT3的磷酸化水平显著增加(P0.05)。结论雄激素受体特异降解剂ASC-J9抑制SOCS3的表达、增加STAT3的磷酸化,表明ASC-J9通过STAT3/SOCS3途径促进巨噬细胞向M2型极化。
【图文】：
Ｃｏｎｔｒｏｌ邋ＥＡＭ逡逑ＥＡＭ小鼠与对照组心脏大小、外观变化。Ｃｏｎｔｒｏｌ：对照组；ＥＡＭ：免疫性小鼠组；逡逑－ｋ－ｋ－ｋ－ｋ逡逑Ｉ逦Ｉ逡逑２０－｜邋逦逡逑１0逡逑ｉ邋0．＿＾ＨＬ＿＿逡逑
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R542.21
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本文编号：
2646289
