骨髓间充质干细胞治疗肺动脉高压的作用及机制研究

发布时间：2020-05-01 14:42

【摘要】：【研究背景】肺动脉高压(pulmonary hypertension,PH)是一种致命的进行性疾病,其主要病理特征为肺血管阻力和肺动脉压力的进行性升高,从而发展为右心室肥厚,右心衰竭甚至死亡。目前国际上认可的肺动脉高压的诊断标准为:在海平面海拔高度、静息状态下,右心导管检测平均肺动脉压(mean pulmonary arterial pressure,mPAP)≥20mm Hg。肺动脉高压发病机制复杂,致死致残率高。血管周围的炎症细胞浸润、肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cell,PASMC)的异常增殖、血管内皮功能障碍是PH的主要病理学基础。尽管目前对其发病机制及治疗已有一定研究进展,也有许多治疗方式可供选择以改善患者的症状,但目前的治疗药物及方法无法改善疾病的危害及延长患者生存时间。间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)存在于体内多种组织细胞中,包括骨髓、脐带血和脂肪组织等。因其在伤口愈合、组织修复、血管生成和免疫调节等方面发挥特异性作用,成为许多疾病的理想治疗靶点。近年来干细胞治疗在心梗、脑缺血、肿瘤等疾病治疗实现了突破性进展。根据国内外研究,干细胞疗法已被证实在野百合碱(monocrotaline,MCT)诱导的大鼠PH模型中是有效的,提示MSC有可能成为临床上治疗肺动脉高压的新策略,但其具体的作用机制目前仍不明确,有待进一步研究。【研究目的】本研究在体内实验采用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)追踪标记的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)移植后在肺组织内的定位、分布及分化情况,并评估BMSC对慢性低氧致肺动脉高压(chronic hypoxia induced-PH,CHPH)和Sugen+低氧致肺动脉高压(sugen-hypoxia induced-PH,SuHx-PH)两种模型的治疗作用,检测BMSC是否影响了血管周围胶原沉积及内皮-间质转化(endothelial-to-mesenchymal transition,EndoMT)的过程。在体外实验中,我们将BMSC与PASMC进行共培养,观测它对缺氧诱导的PASMC增殖及凋亡的影响,我们还用BMSC条件培养基(conditioned medium,CM)对肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells,PMVEC)进行处理,以研究BMSC-CM是否可以通过保护内皮细胞的功能对PH起治疗作用。【研究方法】1.建立CHPH及SuHx-PH动物模型,(1)利用慢病毒转染GFP对BMSC进行标记,通过免疫荧光染色观测BMSC移植后在肺组织内的分布及分化情况;(2)通过观察大鼠的血流动力学及病理学指标,评价BMSC对肺动脉高压的治疗作用;(3)通过Masson染色检测血管周围胶原沉积情况、实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)法检测大鼠肺组织Col I、Col III的mRNA表达变化、免疫组化染色和蛋白质免疫印迹(western blot,WB)法检测大鼠肺组织基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)MMP2和MMP9的蛋白表达变化;(4)通过免疫荧光双染和WB检测内皮及间质细胞标志物蛋白表达水平的变化;2.原代培养PAMSC和PMVEC,与BMSC或BMSC-CM共培养,(1)应用Edu染色法和Annexin V-FITC/PI染色法检测PASMC的增殖与凋亡情况;(2)应用光学显微镜观测PMVEC的细胞形态;(3)通过WB检测PMVEC中内皮及间质细胞标志物蛋白表达水平的变化;(4)通过细胞划痕实验检测BMSC-CM对PMVEC迁移的影响。【实验结果】1.BMSC移植后可在正常大鼠的肺组织内停留,并在缺氧模型组大鼠的肺组织内归巢。2.BMSC治疗明显改善CHPH及SuHx-PH模型大鼠的右心室收缩压、右心肥厚指数以及肺血管重塑。3.BMSC治疗降低CHPH及SuHx-PH模型大鼠肺血管周围胶原沉积以及Col I、ColⅢ、MMP2、MMP9的表达。4.BMSC治疗降低CHPH及SuHx-PH模型大鼠肺组织中间质细胞标志物的表达,升高内皮细胞标志物的表达,抑制CHPH及SuHx-PH模型大鼠肺血管的Endo MT。5.BMSC共培养对低氧诱导的大鼠PASMC的增殖与凋亡情况无明显影响。6.BMSC-CM处理减轻低氧诱导的大鼠PMVEC的EndoMT及迁移。【实验结论】BMSC对CHPH及SuHx-PH模型大鼠具有治疗作用,且这种治疗作用可能是通过旁分泌细胞因子抑制胶原沉积和EndoMT途径来达成的。
【图文】：

广州医科大学硕士学位论文结 果1. BMSC 移植后在 SD 大鼠肺组织内的归巢情况为了确定 BMSC 移植后在 SD 大鼠肺组织内的归巢情况，我们用 GFP 通过慢病毒转染对 BMSC 进行标记，并且尾静脉注射后第 3 小时、1 天、3 天、7 天、14天处死大鼠，，进行肺组织免疫荧光染色。结果如图 1-1 所示，在移植 BMSC 后第 7天（18.2 个细胞/高倍镜视野）肺组织内阳性细胞的数目达到峰值，并在第 14 天（9.8个细胞/每高倍镜视野）逐渐减少。注射生理盐水的对照组未见阳性细胞。如图 1-2示，与常氧组相比，CHPH 组大鼠肺组织内阳性细胞的数目较多，在第 7 和 14 天具有显著统计学差异。

图 1-2：BMSC 移植后在 SD 大鼠肺组织每高倍镜视野下的阳性细胞**P＜0.01 vs 常氧组，***P＜0.001 vs 常氧组；Nor、CH、h、d：同 移植后在 SD 大鼠肺组织内的分布与分化情况证 BMSC 移植后在 SD 大鼠肺组织内的分布与分化情况，我 7 天后的肺组织进行了 GFP（绿色）和 vWF（红色）的荧 所示，我们发现 BMSC 移植后，阳性细胞均匀地分布于肺组内皮细胞。
【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R544.1

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本文编号：2646757