肥大细胞表达Mep-1A促进炎症反应调节AAA发生的分子机制研究

发布时间：2020-05-01 17:27

【摘要】：研究背景:腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)在我国老年人群中常见,发生动脉瘤破裂常致患者猝死。目前对AAA的治疗手段主要还是开放手术和介入治疗。然而这两种治疗手段均有其相应的局限性,对于老年患者及早期患者均不能完全适用。因此深入探索AAA发生机制,对于寻找诊断和治疗的新靶点,实现早期诊断、早期预防、早期药物治疗,具有重要意义。目前AAA的机制研究已经做了大量工作并硕果累累,但目前仍没有有效的药物应用于临床治疗。类似于动脉粥样硬化,慢性炎症反应是AAA重要机制,肥大细胞(mast cell,MC)和免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)导致的动脉壁炎症反应、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)降解在AAA该过程中起重要作用。文献提示Meprin-α(Mep1A基因表达)作为金属内肽酶,通过改变蛋白质和炎症因子活性,在动脉粥样硬化的发病中扮演着重要角色。主动脉壁中的Meprin A可以分解血管活性肽,也可激活炎性细胞因子促进炎症,并且最终加速ECM的降解并促进血管重塑。如抑制或敲除Meprin A可能会减弱动脉壁炎症,抑制主动脉管壁的重塑。在上述研究报道的基础上,我们推测如将小鼠的MeplA基因敲除,其炎症反应应该显著降低,小鼠AAA的形成和进展也将受到抑制。目的:研究Mep1A基因通过炎症机制在AAA形成和破裂过程中的作用及机制。研究方法:(1)人体标本检测:收集AAA患者动脉瘤壁组织和正常成人的主动脉壁组织,应用免疫组织化学染色检测组织标本中Meprin-α的表达是否不同。收集正常人和AAA患者的血清标本,检测正常人、AAA患者经他汀类药物治疗和未经他汀类药物治疗等情形下血清炎症因子,比较其不同;检测AAA患者经他汀类药物治疗前后炎症因子的变化情况。本步骤揭示Meprin-α和炎症因子在人体AAA发病机制中的重要作用。(2)小鼠的培养和AAA模型的建立:使用Apoe-/-Mep1A-/-小鼠及其同窝的Apoe-/-Mep1A+/+小鼠作为实验对照,实验前和取材前均测量体重和血压,通过皮下置入含有血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,Ang-Ⅱ)微型渗透泵的方法诱导AAA形成。(3)小鼠主动脉组织免疫组织化学分析:应用免疫组织化学染色的方法,对小鼠动脉瘤壁组织和主动脉壁组织中巨噬细胞(Mac-3),T细胞(CD4),肥大细胞(CD117),主要组织相容性复合物-Ⅱ(major histocompatibility complex-Ⅱ,MHC-Ⅱ),MCP-1,弹力蛋白,CD31,TUNEL和Mep1A,TNF-α等进行免疫染色。通过测量免疫组化染色信号的阳性面积来量化主动脉组织中的巨噬细胞和MCP-1的相对含量。病灶中CD31+的微血管和CD4+T细胞用每平方毫米的数量来进行定量。将弹力蛋白的降解程度根据Deckert等报道的分级要点进行分级。(4)实时聚合酶链式反应(RT-PCR):使用Trizol试剂从AAA组织提取总细胞RNA。然后用无RNA酶的DNA酶处理RNA样品以去除基因组DNA污染物。反转录等量的RNA,并在单色实时聚合酶链式反应(RT-PCR)检测系统中进行定量PCR。将TNF-α和Mep1 A的mRNA水平标准化为管家基因——GAPDH的mRNA水平。(5)Western Blot分析:主动脉组织或细胞在裂解缓冲液中提取蛋白。将等量的蛋白质提取物加载到8%或12%SDS-PAGE凝胶上,转移到硝酸纤维素膜上,并用山羊抗兔Mep1 A多克隆抗体,山羊抗兔TNF-α多克隆抗体检测相应蛋白。同时应用持家蛋白甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的进行免疫印迹以确保相等的蛋白质加载量。本研究在细胞实验中也应用Western Blot对IgE刺激MCs后产物中的信号分子进行了检测。(6)酶联免疫吸附测定法(ELISA):使用ELISA试剂盒对Apoe-/-Mep1A+/+和Apoe-/-Mep1A-/-小鼠血清及细胞培养上清液中测定血浆中的TNF-α水平。用0.5mmol/L的H2SO4终止反应并在450nm读取吸光度。使用Graphpad Prism 5.0图形软件包计算标准曲线。然后参照标准曲线确定目标基因浓度。(7)细胞培养和小干扰RNA(siRNA)干预:根据制造商的方案,将培养的肥大细胞应用Mep1A的siRNA进行转染。生长24小时后将粘附80%的细胞彻底洗涤并收获。研究结果:1.使用免疫组织化学染色在人AAA组织和AngⅡ诱导的小鼠AAA组织中发现Mep1A的表达增加。2.Ang Ⅱ诱导ApoE-/-小鼠成功的建立了 AAA动物模型。3.Mep1A缺陷提高了 AAA小鼠的存活率。4.病理分析显示Mep1A的缺失降低了 AAA组织中的弹力层的降解和VSMC凋亡。5.通过rt-PCR,WestemBlot和ELISA等方法,在体外机制研究发现,Mep1A主要在肥大细胞(MCs)中表达,并介导TNF-α的表达。6.MCs分泌的TNF-α促进VSMCs中MMPs的表达,促进VSMC凋亡。7.在人体血清标本中证实,AAA患者血清中Meprin-α和TNF-α也表达增加,而经过他汀类药物短期治疗后,炎症因子TNF-α显著降低。8.总体来说,本研究发现Mep1A在肥大细胞中通过分泌TNF-α介导AAA破裂,其促进血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)的表达和促进弹性蛋白降解的细胞凋亡。结论:综合起来,我们的研究数据表明Mep1A在MC中表达量调高,可通过介导MC中TNF-α的分泌,而促进VSMC中MMPs的表达和中层弹力蛋白的降解,以及促进VSMC的凋亡,从而在AAA发生发展的病理生理学中发挥至关重要的作用。敲除Mep1A显著提高了小鼠AAA的稳定性并降低了小鼠死亡率。因此,Mep1A可能成为降低AAA死亡率的新的治疗靶点。
【图文】：

邋ＷＴ）＋盐水组：Ａｐｏｅ＿Ａ邋ＭｅｐｌＡ＋／＋（邋ＷＴ）小鼠，以盐水栗进行假手术；②ＷＴ＋ＡｎｇＩＩ逡逑组：Ａｐｏｅｖ＿ＭｅｐｌＡ＋／＋邋（ＷＴ）小鼠，用邋Ａｎｇｌｌ邋处理；③敲除型（ｋｎｏｃｋｏｕｔ，邋ＫＯ）邋＋ＡｎｇＩＩ逡逑组：ＡｐｏｅｉＭｅｐｌＡ－ｚ—邋（Ｋ０）小鼠，用Ａｎｇｌｌ处理。如图１Ａ和１Ｂ所示，三组动物逡逑标本取材后经Ｍｅｐｒｉｎ－ａ免疫组化染色，提示ＭｅｐｌＡ在Ａｎｇｌｌ处理后的ＷＴ小鼠的逡逑血管中高度表达，而在未经Ａｎｇｌｌ处理的小鼠和在Ｍｅｐｌ敲除（Ｋ０）小鼠主动脉中逡逑但中表达不高。提示①Ａｎｇｌｌ诱导小鼠主动脉表达ＭｅｐｌＡ增加；②本实验中ＭｅｐｌＡ逡逑敲除成功。逡逑ＭｅｐｌＡ免疫组化染色逡逑Ａ逡逑，：巧灌衡：：：３逡逑Ａｐｏｅ．ＡＭｅｐ１Ａ＋／＋逦Ａｐｏｅ＿／＊Ｍｅｐ１邋Ａ＋／＋＋Ａｎｇ邋１１逦Ａｐｏｅ＇ＡＭｅｐ邋１邋Ａ＇Ａ＋Ａｎｇ邋１１逡逑Ｂ邋一一，逦—逦逦—邋ａ邋Ａｐｏｅ－ＡＭｅｐ１Ａ＋／＋逡逑ｇ邋Ｓ逦□邋Ａｐｏｅ＊ＡＭｅｐ１Ａ＋／＋＋Ａｎｇｌｌ逡逑ｃ邋＾邋４－逦￣￣｜逦■邋ＡｐｏｅＡＭ印邋１Ａ．Ａ＋Ａｎｇｌｌ逡逑Ｏ邋＞逡逑＜＾２逡逑－ｒ－逡逑＾逡逑图１．邋ＭｅｐｌＡ在小鼠ＡＡＡ组织中的表达。（Ａ）邋ＭｅｐｌＡ在小鼠ＡＡＡ组织中的免疫逡逑组织化学。（Ｂ）条形图显示小鼠中ＭｅｐｌＡ阳性区域的百分比。＊示逡逑Ａｐｏｅ－／－ＭｅｐｌＡ＋／＋＋Ａｎｇ邋ＩＩ邋组ＭｅｐｌＡ邋的表达量高于邋Ａｐｏｅ－ＡＭｅｐｌＡ＋／＋组，Ｐ＜０．０５，即邋Ａｎｇｌｌ逡逑刺激主动脉壁邋Ｍｅｐｌ邋Ａ邋表达增加（ｔ＝２．６４２

我们接下来就测试了邋ＭＭＰｓ是否参与了邋ＭｅｐｌＡ介导的ＡＡＡ形成。小鼠主动逡逑脉的免疫组化染色数据显示，，与ＷＴ小鼠相比，ＭｅｐｌＡＫＯ小鼠中ＭＭＰ２和ＭＭＰ９逡逑的表达显著降低（图３Ｂ和３Ｃ）。同时，ＲＴ－ＰＣＲ的结果显示，ＡＡＡ组织中ＭＭＰ２逡逑和ＭＭＰ９的ｍＲＮＡ水平反映了染色结果（图３Ｄ）。由于细胞凋亡对于血管壁的病逡逑理性重构也是至关重要的，所以我们还检测了模型小鼠主动脉壁中的细胞凋亡情逡逑况。在我们对小鼠主动脉壁ＴＵＮＥＬ染色的统计中，ＭｅｐｌＡＫＯ小鼠的ＡＡＡ组织中逡逑细胞凋亡的阳性率（２．３５％）显著低于ＷＴ小鼠（６．８７％）（图３Ｅ）。这些数据表明逡逑ＭｅｐｌＡ缺陷可能通过降低弹性蛋白的降解和细胞凋亡来抑制ＡＡＡ破裂。逡逑３６逡逑
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R543.16

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本文编号：2646886