心梗后心室重构大鼠心肌组织中长链非编码RNA差异性表达的研究

发布时间：2020-05-01 22:44

【摘要】：世界卫生组织报告,冠心病已成为全球首位的死亡原因。急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是心肌严重而持久地急性缺血引起的心肌细胞死亡。心室重构(ventricular remodeling,VR)是指心肌梗死后在血流动力学、神经体液等因素综合作用下,心脏从基因到结构发生改建,代谢和功能发生改变的过程。VR是急性心肌梗死后最终发展为心力衰竭(heart failure,HF)的基本病理过程,是影响急性心肌梗死预后的主要原因。因此,如何减缓或者逆转急性心肌梗死后的VR,预防HF的发生,是心肌梗死二级预防面临的重大难题。长链非编码RNAs(Long non-coding RNA,lncRNAs)是一类长度超过200nt的转录本,其本身不能编码蛋白。起初它被认为不具有生物学功能,然而,研究表明lncRNAs具有广泛的生物学功能,它们以RNA形式在多种层面上调控基因表达水平。为探讨复杂疾病的病理机制提供一个新的研究领域。本实验是通过基因芯片实验来筛选心梗后心室重构大鼠心肌组织中差异表达的lncRNAs,以此为基础期望能够发现心室重构特异lncRNA的靶标基因,为心室重构提供新的诊断依据和防治手段。目的:筛选心梗后心室重构大鼠心肌组织中差异性表达的lncRNAs和mRNAs,并通过生物信息学分析技术对差异表达的mRNAs进行功能、途径富集和lncRNAs-mRNAs共表达网络的构建,以期找到与心梗后心室重构相关的靶标基因。方法:1.大鼠心肌梗死后心室重构模型制备60只健康SPF级雄性SD(Sprague Dawley)大鼠,体质量(200±20)g基础饲料适应性喂养一周后,随机选取45只大鼠在左冠状动脉前降支进行结扎来制备急性心肌梗死模型,剩余15只在相同部位只穿线不结扎做为假手术处理。从模型成功且存活的大鼠中随机挑出10只做为模型组,再从假手术成功且存活的大鼠中随机挑出10只做为假手术组。术后4周,血流动力学检测两组大鼠心功能,HE染色及Masson染色观察两组大鼠心肌组织病理学变化和心肌纤维化程度。2.基因芯片实验分别从模型组和假手术组中随机挑选3只大鼠的心肌组织样本来进行基因芯片实验。提取模型组大鼠心脏梗死区心肌组织的总RNAs和假手术组相同部位心肌组织的总RNAs,纯化、检验RNA的质量。合成c DNA后进行芯片杂交实验。进行芯片图像扫描并使用Agilent Gene Spring GX V11.5软件对芯片数据进行归一化和差异性分析。使用箱线图对芯片数据进行质量评估。用差异比较分析、差异聚类分析、散点图、火山图的方法对差异表达的lncRNAs和mRNAs进行分析得到差异表达的lncRNAs和mRNAs的汇总信息。使用KOBAS 3.0对差异的mRNAs进行GO功能分析、KEGG和PANTHER pathwy分析。利用Cytoscape 3.6.0软件构建lncRNAs-mRNAs共表达网络。结果:1.对心功能的影响与假手术组相比,模型组大鼠左室收缩压(LVSP)和左室压最大上升和下降速率(±dp/dtmax)明显下降(P0.01),左室舒张末压(LVEDP)明显上升(P0.01)。2.HE和Massson染色结果HE染色显示模型组心肌组织中出现大量心肌细胞坏死,假手术组大鼠心肌细胞形态正常;Masson染色显示模型组大鼠心肌胶原纤维相比假手术组明显增多形成片状,假手术组大鼠胶原纤维散在分布。3.芯片数据质量评估通过箱线图对芯片数据分析,样本数据相似性好,芯片数据质量较好。4.差异表达的lncRNAs和mRNAs与假手术组相比,差异表达的lncRNAs为74条,占检测总lncRNAs探针的0.402%。其中上调的有50条,下调的有24条。2.5倍以上变化的共31个,其中上调22个,下调9个;5倍以上变化的共2个,其表达是上调的。差异表达的mRNAs为116条,占检测总mRNAs探针的0.44%。其中上调的有99条,下调的有17条。5.差异mRNAs的功能途径分类:GO分析以P0.05为阈值,显著富集有693个。其中前50个中与心梗后心室重构可能相关的有:cell surface receptor signaling pathway,immune system process,positive regulation of cytokine production,response to stimulus,regulation of cytokine production,cytokine production。KEGG和PANTHER途径分析以P0.05为阈值,得到途径有42个,与心梗后心室重构相关的生物途径有:Rap1 signaling pathway,Cytokine-cytokine receptor interaction,Ras signaling pathway,NF-kappa B signaling pathway,MAPK signaling pathway,HIF-1 signaling pathway,Inflammatory mediator regulation of TRP channels。6.lncRNAs-mRNAs共表达网络图15.A是由74个差异表达的lncRNAs和116个差异表达的mRNAs的构建的共表达网络总图。图A共有174个节点,1975个边。B、C、D图是A的有显著相关性的子节点图。7.研究目的lnRNAs的确定通过挖掘lncRNAs-mRNAs共表达网络图,子节点图关联mRNAs的功能分析及基因位点分析后,最终确定3条上调lncRNAs:LOC103691864、NONRATT015650、NONRATT031004;3条下调lncRNAs:NONRATT025704、LOC102552965、NONRATT012533。结论:1.与假手术组相比,心梗后心室重构大鼠心肌组织中差异性表达的lncRNAs有74条和mRNAs有116条。2.使用KOBAS 3.0平台对差异表达的mRNAs进行GO功能分析、KEGG和PANTHER pathwy分析后,发现与心梗后心室重构可能相关的功能有:cell surface receptor signaling pathway,immune system process,positive regulation of cytokine production,response to stimulus,regulation of cytokine production,cytokine production。与其相关的途径有:Rap1signaling pathway,Cytokine-cytokine receptor interaction,Ras signaling pathway,NF-kappa B signaling pathway,MAPK signaling pathway,HIF-1signaling pathway,Inflammatory mediator regulation of TRP channels。3.通过对lncRNAs-mRNAs共表达网络图的分析,子节点关联mRNAs的功能分析及基因位点分析,最终筛选出6条候选lncRNAs:LOC103691864、NONRATT015650、NONRATT031004、NONRATT025704、LOC102552965、NONRATT012533。这6条lncRNAs将在心梗后心室重构大鼠模型中进行验证并在其后续实验中进行功能和机制研究。
【学位授予单位】：承德医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R542.22

【参考文献】