miR-214调控pim-1蛋白的表达在心肌肥厚中的作用及机制

发布时间：2020-05-07 03:13

【摘要】：研究背景及目标:心肌肥厚是由于多种因素导致心脏的肥厚性病理改变,可逐渐导致心脏功能下降,心肌细胞肥大及间质增生是其最基本的特征。心肌肥厚的发病机制目前仍未完全阐明。最近研究发现microRNA在生物体内发挥广泛的调节作用,与疾病的发生发展密切相关。本研究的目的是观察miR-214在心肌肥厚发病中的作用并探讨详细的作用机制。研究方法:1C57BL/6野生型小鼠(WT)150只分成3个体重组(n=50)后再分成5个小组(n=10)分别用作4个腹主动脉缩窄组(AAC组)及假手术组(sham组),AAC组观察存活率,统计心脏肥厚相关指数,以寻找最适合的建模方式。2取新生大鼠原代心肌细胞通过苯肾上腺素刺激构建心肌肥厚细胞模型,生物信息学筛查miR-214功能性靶基因,通过双荧光素酶报告实验、miR-214敲低和过表达后检测靶基因蛋白表达变化等方法验证miR-214与预测靶基因的调控关系。并在蛋白表达水平验证miR-214与其靶基因对于心肌肥厚相关蛋白及下游信号通路的调控作用,探索详细的作用机制。3获得心肌miR-214条件性敲除(KO)小鼠并进行鉴定,研究WT小鼠和KO小鼠AAC术后心肌肥厚的差异,以及miR-214靶基因相关蛋白的表达差异,进一步在活体水平验证miR-214对于心肌肥厚的调控作用及相关的作用机制。结果:1AAC缩窄过重会导致小鼠死亡,相同束缚强度下小鼠的死亡率和体重正相关,使用0.45mm和0.50mm针头都可以建立心肌肥厚模型,致使小鼠心肌细胞增大和间质增生,心功能降低以及身体发育受限。2生物信息学预测发现pim-1可能是miR-214的靶基因。双荧光素酶报告实验显示miR-214可以结合在pim-1的3'UTR区域并降低pim-1的转录活性;通过过表达和敲低miR-214的表达发现,拮抗miR-214可以使pim-1的表达增加,反之,过表达miR-214可以抑制pim-1的表达,进一步证实了 miR-214与pim-1之间存在直接的调控关系。3在心肌肥厚细胞模型中,过表达miR-214时,心肌细胞肥大标志物(ANP、BNP和Myh7)表达明显降低,而在抑制miR-214的表达后,心肌肥厚相关蛋白明显升高。进一步的研究发现,miR-214可以通过抑制pim-1的表达,抑制JAK/STAT信号通路激活进而影响心肌细胞肥大标志物的表达。4、WT小鼠心肌肥厚模型中,心肌miR-214表达下降,pim-1和ANP、BNP、Myh7蛋白表达增加;与此同时,miR-214KO小鼠建模后心肌肥厚更为明显,pim-1和ANP、BNP、Myh7的表达也更高。结论:本研究组成功建立了心肌肥厚模型,发现miR-214在心肌肥厚的发生过程中发挥了重要作用。miR-214可以通过降低pim-1的表达,抑制JAK/STAT信号通路的激活,进而降低了心肌肥厚程度。心肌miR-214缺失时,心肌肥厚明显加重。因此,miR-214可能是防治心肌肥厚的新靶点。
【图文】：

基因序列,核酸,心肌细胞肥大

２原代心肌细胞经ＰＥ处理后外径和蛋白表达的变化。Ａ：邋４００ｘ显微镜下原代细胞的影像，与Ｃｔｒｌ组相比可见，ＰＥ组的原代心肌细胞更为饱满，面积更大。逡逑：细胞外径的统计，可见ＰＥ组有着显著的提高。Ｃ：邋ＡＮＰ、ＢＮＰ和Ｍｙｈ７的ＷＢ影，可见经ＰＥ处理后，心肌细胞肥大标志物的表达都有不同程度的升高。逡逑．２邋ｍｉＲ－２１４在ｍＲＮＡ和蛋白水平调控ｐｉｍ－１表达逡逑（１）ｐｉｍ－ｌ的３’ＵＴＲ中可见两个高度保守的ｍｉＲ－２１４的结合位点，分别位于（ｔａｒｇｅｔ邋ｓｉｔｅｓ）邋６０８邋和邋１３４３。（图邋３邋Ａ）逡逑（２）逦Ｔｗｏ－ｓｔａｔｅ邋ｍｅｌｔｉｎｇ绘制了核酸二级结构，并发现ｐｉｍ－１的３＇ＵＴＲ中的两合位点均可以与ｍｉＲ－２１４的一部分序列结合，，并形成稳定的核酸二级茎环结构逡逑（图邋３邋Ｂ）。逡逑（３）逦ｍｉＲ－２１４已有被报道和心肌肥厚有关，ｐｉｍ－１也曾被报道对细胞增殖有关逡逑５］。逡逑

互补基因,二级结构,质粒,直接结合

－２１４与ｐｉｍ－１的ｍＲＮＡ中互补基因序列的二级结构图。可个与ｍｉＲ－２１４的结合成稳定的茎环结构的位点，更进一步依据。逡逑１４通过直接结合ｐｈｎ－１邋３＊１７０１下调ｐｉｍ－１的表达逡逑ｍｉＲ－２１４是否能够直接结合ｐｉｍ－ｌ邋３＇ＵＴＲ，并且进一步抑制ｐ对ｐｉｍ－１邋３’ＵＴＲ基因片段克隆了两个具有高度保守的ｍｉＲ－过在其插入荧光素酶报告质粒进行了检测（ＷＴ－ｌｕｃ）。结行过表达后，受到ｐｉｍ－１邋３＇ＵＴＲ调控的荧光素酶的活性有着继而我们对ｐｉｍ－１邋３＇ＵＴＲ上的ｍｉＲ－２１４的两个结合位点进ａｎｔｌ－ｌｕｃ和Ｍｕｔａｎｔ２－丨ｕｃ具有单个位点突变的两个报告质粒，变的Ｍｕｔａｎｔｌ／２－ｌｕｃ报告质粒（图４Ｂ），并使用突变质粒进。，论Ｍｕｔａｎｔｌ－ｌｕｃ和Ｍｕｔａｎｔ２－ｌｕｃ，还是Ｍｕｔ
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R542.2

【参考文献】