间充质干细胞来源的微颗粒对异丙肾上腺素诱发心肌细胞肥大的抑制作用及其机制的初步研究

发布时间：2020-05-16 06:32

【摘要】：目的制备间充质干细胞来源的微颗粒(MSC-MPs),观察其对ISO诱导H9C2心肌细胞肥大的影响,并初步分析其作用机制。方法全骨髓贴壁法培养MSCs,通过显微镜观察细胞形态学变化、细胞计数法绘制生长曲线和流式细胞术鉴定细胞表面标记三方面对MSCs进行综合鉴定。用MPs-free培养基饥饿处理第5代MSCs 48h,收集细胞上清液,梯度离心获得MSC-MPs。利用流式细胞术检测MSC-MPs表面阳性标志物CD29和CD90,以及阴性标志物CD34和CD45的表达情况。BCA蛋白浓度试剂盒和流式检测所获得MSC-MPs的蛋白含量和数目。用5μmol·L~(~(-1)) ISO作用于H9C2心肌细胞48h建立心肌肥大模型,观察12-48μg·ml~(~(-1)) MSC-MPs处理肥大心肌细胞48h后,其对心肌细胞表面积、胞内总蛋白含量等指标的影响,主要包括:用Dimension软件采集各组心肌细胞形态学图片并测量心肌细胞表面积;BCA法检测各组心肌细胞蛋白含量;q RT-PCR检测各组心肌细胞ANP、BNP、β-MHC m RNA水平的变化情况;CCK-8法检测心肌细胞活力的改变。实验分为6组:(1)空白对照组(Control):加入培养基和等体积无MPs的PBS;(2)心肌细胞肥大组(ISO):含5μmol·L~(~(-1)) ISO的培养基;(3)MP(12μg·ml~(~(-1)))组:含5μmol·L~(~(-1)) ISO和12μg·ml~(~(-1)) MPs的培养基;(4)MP(24μg·ml~(~(-1)))组:含5μmol·L~(~(-1)) ISO和24μg·ml~(~(-1)) MPs的培养基;(5)MP(48μg·ml~(~(-1)))组:含5μmol·L~(~(-1)) ISO和48μg·ml~(~(-1)) MPs的培养基;(6)上清液组(Supernatant):含5μmol·L~(~(-1)) ISO和等体积上清液的培养基。为进一步分析MSC-MPs的作用机制,用荧光显微镜和流式细胞仪分别检测细胞内活性氧(ROS)的改变。实验分为以下4组:(1)空白对照组(Control):加入培养基和等体积无MPs的PBS;(2)心肌细胞肥大组(ISO):含5μmol·L~(~(-1)) ISO的培养基;(3)MP(48μg·ml~(~(-1)))组:含5μmol·L~(~(-1)) ISO和48μg·ml~(~(-1)) MPs的培养基;(4)上清液组(Supernatant):含5μmol·L~(~(-1)) ISO和等体积上清液的培养基。结果1.本实验获得的骨髓间充质干细胞镜下呈短梭形、多边形的集落生长,旋涡状排列。细胞生长曲线大致呈现“S”形,细胞具有很强的增殖能力。MSCs的阳性表面标志物CD29和CD90的表达率分别为(97.66±1.30)%、(98.65±0.50)%,阴性表面标志物CD45和CD34的表达率分别为(0.31±0.12)%、(1.90±0.52)%。2.梯度离心法获得的MSC-MPs,BCA结果显示其蛋白浓度为(592.74±5.20)μg·ml~(-1)。流式结果显示其数目为(2.69±0.21)×107个/ml。流式检测结果显示,MSC-MPs的表面阳性标志物CD29和CD90的表达率分别为(87.61±3.43)%、(98.04±0.61)%,阴性表面标志物CD45和CD34的表达率分别为(2.65±0.47)%、(3.43±0.42)%。3.结果显示,在1-30μmol·L~(-1)范围内,心肌细胞表面积随ISO浓度增加呈现浓度依赖性的增大(P0.001)。用不同浓度的ISO分别作用于心肌细胞24h和48h后,BCA结果显示,ISO浓度在1-30μmol·L~(-1)内呈浓度依赖性和时间依赖性的增加心肌细胞蛋白含量。5μmol·L~(-1) ISO作用心肌细胞48h,细胞蛋白含量增加了23%(P0.001)。因此,选择5μmol·L~(-1) ISO作用心肌细胞48h建立心肌细胞肥大模型。4.MSC-MPs对肥大心肌细胞表面积的作用:与ISO组细胞表面积(1572.90±122.23)μm~2相比,MSC-MPs(12μg·ml~(-1)、24μg·ml~(-1)、48μg·ml~(-1))将细胞表面积分别减少到(1215.51±107.19)μm~2、(1167.94±46.05)μm~2、(949.71±36.05)μm~2(P0.001)。与ISO组相比,MSCs上清液对肥大心肌细胞的表面积无明显的作用。5.MSC-MPs对肥大心肌细胞蛋白含量的作用:与control组相比,ISO组细胞蛋白含量明显增多(P0.001)。12-48μg·ml~(-1) MSC-MPs对肥大心肌细胞呈现浓度依赖性降低细胞蛋白含量。MSC-MPs浓度在48μg·ml~(-1)时,相比ISO组,细胞蛋白含量降低最明显,降低率为24%,具有统计学差异(P0.001)。MSCs上清组对肥大心肌细胞的蛋白含量未见明显作用。6.MSC-MPs对肥大心肌细胞ANP、BNP、β-MHC m RNA的表达变化:结果显示,5μmol·L~(-1) ISO刺激心肌细胞48h后,ANP、BNP、β-MHC m RNA表达增加量分别为control组的3.2倍、1.3倍和3.2倍。12~48μg·ml~(-1)浓度范围内MSC-MPs对肥大心肌细胞m RNA的表达呈浓度依赖性的抑制作用(P0.05)。上清液组细胞内m RNA表达量未见明显变化。7.ISO和MSC-MPs对H9C2心肌细胞增殖能力的影响。结果显示,运用CCK-8法检测5μmol·L~(-1) ISO和12、24、48μg·ml~(-1) MSC-MPs均不会影响H9C2心肌细胞的增殖能力。8.MSC-MPs对肥大心肌细胞ROS含量的变化:实验结果显示,与control组ROS水平(10.14±0.70)%相比,ISO组ROS水平显著升高至(53.51±2.91)%(P0.001);使用48μg·ml~(-1) MSC-MPs干预后,ROS水平降至(11.28±0.59)%,表明MSC-MPs能够显著抑制ISO诱导的ROS增加(P0.001)。结论1.在分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞的基础上,成功诱导并获得高质量MSC-MPs;2.在12-48μg·ml~(-1)浓度范围内,MSC-MPs可显著抑制ISO诱导的心肌细胞肥大,该作用可能与其降低心肌细胞内活性氧水平和抑制氧化应激有关。
【图文】：

大鼠,情况,梭形,细胞生长速率

山西医科大学硕士学位论文2 结果2.1 MSCs 的形态学特征初始接种于培养瓶中呈现为大小不一的圆形，混有各种血细胞。48h 后首次换液，镜下观察到有细胞呈短梭形、多边形的集落生长。细胞集落不断增多，呈“旋涡状”排列，10 天左右细胞融合至 85%-90%。传代后细胞生长速率加快，4-5天长满瓶底进行下一次传代。传至 2 代后，得到高纯度的 MSCs。8 代以内细胞形态仍为梭形，，生长代谢旺盛（见图 1-1）。

细胞生长曲线,表面标志,表达率,标志物

图 1-2 第 5 代 MSCs 细胞生长曲线Cs 表面标记物的表达情况验选取第 3 代和第 5 代 MSCs 运用流式细胞仪对其表面标志液和传代，血细胞等杂细胞几乎全部被除去，得到 MSCs。第s 的阳性表面标志物 CD29 和 CD90 的表达率均在 95%以上，D45 和 CD34 的表达率均小于 5%（见表 1-1，图 1-3）。第 3 代面标记物表达差异均无统计学意义（P㧐0.05）。表 1-1 P3 代和 P5 代 MSCs 表面标志物的表达(x ±s，n=3)阳性标志物（＋）阴性标志物（－CD29 (%) CD90 (%) CD34 (%) C3 代） 97.66±1.30 98.65±0.50 0.31±0.12 1.95 代） 97.72±1.22 98.57±0.48 0.36±0.11 2.3
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R54

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