肺泡上皮细胞在低氧性肺动脉高压中的作用及机制研究

发布时间：2020-05-26 01:56

【摘要】：低氧性肺动脉高压(Hypoxic pulmonary hypertension,HPH)常见于多种慢性呼吸系统疾病和慢性高原病。它是肺动脉高压(Pulmonary hypertension,PH)中较常见一种类型,以肺血管重构及收缩为特征性病理改变。肺血管收缩引起肺动脉压升高,长期肺动脉压升高导致肺血管重构,加重肺动脉高压,最后诱发右心衰竭。以往大量研究证实,肺动脉高压形成是由多因素引起,如血管内活性物质、血管内皮细胞、血管壁外膜成纤维细胞等参与肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)收缩、增殖和凋亡,然而甚少关注肺泡上皮细胞对HPH的影响。肺泡作为气体交换的首要场所,肺泡上皮细胞(AEC)是呼吸膜的组成部分,是最早感知肺泡内氧分压变化的细胞。文献报道,只有在肺泡缺氧才能引起HPH,其它类型缺氧如循环型、血液型和组织型缺氧并不引起PH,而且肺泡低氧时只有肺部动脉壁(包括支气管动脉)发生重构,外周体循环动脉壁不发生明显的重构。基于上面的理论,我们认为,低氧信号始动的传递方向应该是从AEC到肺间质微环境,再穿过肺血管壁传向血液。其次,健康状态下肺泡氧分压是105mmHg,在5000~6000m的海拔高度肺泡氧分压在45mmHg~40mmHg,因此AEC遭受到的氧分压变化是60mmHg~65mmHg,而动脉内皮细胞健康状态时接触的是静脉血,混合静脉血的氧分压是40mmHg,即使在低氧状态下,静脉血氧分压也不会低于20mmHg,所以肺血管内皮不如AEC遭受的氧分压变化剧烈。因此AEC是最早感知氧分压变化和遭受氧分压变化最剧烈的细胞,同时也是最早改变肺部微环境的细胞。另外,我们的研究结果表明,低氧肺动脉高压模型大鼠肺动脉压升高,主动脉压(体循环压)不发生明显的改变,处于肺微环境中的肺小动脉和属于体循环的支气管动脉发生结构重建,而属于体循环不在肺微环境的肾动脉不发生重建;给予肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)和体循环血管主动脉平滑肌细胞(AASMCs)不同氧浓度(5%O_2、10%O_2、21%O_2)处理,PASMCs发生明显增殖,而AASMCs增殖不明显,说明单纯低氧不足以引起体循环血管结构重建,肺部微环境在血管的重构和收缩中也发挥了一定的作用。因此我们提出肺动脉高压发生发展的“微环境说”,即肺血管周围的pH值、渗透压、氧浓度、分泌物质及代谢产物的变化都会直接影响血管的结构和功能。根据文献和我们实验结果,认为ROS是造成肺微环境改变的主要因素之一,而在低氧情况下引起肺微环境变化的最早的根源是AEC。因此,本实验复制低氧条件AEC与PASMCs共培养细胞模型以及低氧肺泡上皮细胞培养上清液对离体肺血管影响模型,从AEC的角度,改变肺血管或PASMCs微环境,以ROS中H_2O_2为切入点,研究肺泡上皮细胞在HPH发生发展中的作用,从整体、离体血管和细胞水平探讨AEC对肺血管张力和肺动脉壁重建的影响及其机制,为HPH的发病机制提供新的理论基础,为防治HPH提供新的靶点。【研究目的】1、明确肺泡上皮细胞在HPH中肺血管重构和肺血管收缩中的作用。2、以ROS中H_2O_2为切入点,深入地探讨肺泡上皮细胞在低氧性肺血管重构和肺血管收缩中作用机制。【研究方法】一、动物实验1、成年雄性SD大鼠随机分为:常氧组(normoxia,N)、低氧组(hypoxia,H),常氧组大鼠,在常氧条件下(21%O_2)饲养4周;低氧组大鼠,每天在低压低氧舱内(10%O_2)暴露8 h,连续低氧4周。一个月后,分别检测各组大鼠右室收缩压(right ventricle systolic pressure,RVSP)、主动脉压(mCAP)、右室肥厚指数[RV/(LV+Sep)]、肺小动脉、支气管动脉和肾动脉的中膜厚度百分比(medial thickness%,MT%)及面积百分比(medial area%,MA%)等,观察其在常氧和低氧条件下变化的差异。二、细胞实验1、原代培养ATII、PASMCs和AASMCs,利用透射电镜,免疫细胞化学染色和免疫荧光对原代培养的ATII、PASMCs和AASMCs进行鉴定,同时购买大鼠肺泡上皮细胞系RLE-6TN。2、取3-5代对数生长期的原代培养的PASMCs和AASMCs在不同氧浓度条件下(21%O_2、10%O_2、5%O_2)干预48 h,MTT和细胞计数法观察不同氧浓度对PASMCs和AASMCs增殖的影响。3、利用Transwell将原代培养的PASMCs和AASMCs分别与ATII和RLE-6TN共培养48 h,MTT法观察不同氧浓度(21%O_2、5%O_2)培养条件下肺泡上皮细胞对PASMCs和AASMCs增殖的影响。4、收集原代培养ATII和RLE-6TN不同氧浓度(21%O_2、5%O_2)培养上清液,MTT法观察肺泡上皮细胞条件培养上清液作用于PASMCs和AASMCs 48 h对其增殖影响。5、收集不同氧浓度(21%O_2、5%O_2)培养48h原代ATII细胞,委托北京源宜基因科技有限责任公司进行基因检测,同时进行QT-PCR检测验证差异基因的表达情况。6、根据基因检测的结果,利用商业试剂盒对原代ATII细胞中的SOD活力和含量及H_2O_2进行检测,利用流式细胞术对原代ATII细胞中总的ROS进行检测,利用商业试剂盒对原代ATII细胞及其培养液中H_2O_2进行检测。7、利用不同浓度(0μM、5μM、10μM、50μM、100μM、200μM、400μM、800μM、1000μM)外源性H_2O_2,48h后观察对PASMCs和AASMCs增殖影响。选择对PASMCs和AASMCs增殖影响最明显H_2O_2浓度,观察不同浓度ROS清除剂NAC(5mM、10mM)对H_2O_2诱导PASMCs和AASMCs增殖影响。8、利用Transwell将原代培养的PASMCs和AASMCs分别与ATII和RLE-6TN共培养,加入10mM NAC后,48h后观察PASMCs和AASMCs增殖的变化。三、离体肺血管实验1、分离正常大鼠和HPH大鼠肺内三级肺小动脉和主动脉,制备完整的肺小动脉(PA)环和主动脉(AA)环。用苯肾上腺素(PE)预收缩血管环,检测血管环活性。2、收集原代培养ATII和RLE-6TN不同氧浓度(21%O_2、5%O_2)培养上清,观察对正常大鼠及HPH大鼠离体PA和AA收缩的影响。3、利用不同浓度(5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、200μM、400μM、600μM、800μM、1000μM)外源性H_2O_2观察对正常大鼠PA和AA收缩的影响。选择对PA和AA收缩影响最明显H_2O_2浓度,不同浓度ROS清除剂NAC(5mM、10mM)处理后,观察PA和AA收缩变化。4、收集原代培养ATII和RLE-6TN不同氧浓度(21%O_2、5%O_2)培养上清,加入10 mM NAC后,观察对PA和AA收缩的影响。【研究结果】1、HPH组大鼠RVSP、RV/(LV+S)%以及肺小动脉的MT%和MA%明显高于正常大鼠组,而两组大鼠mCAP却差异不明显;HPH大鼠组属于体循环支气管动脉MT%和MA%明显高于正常大鼠组,而两组大鼠属于体循环的肾血管MT%和MA%差异不明显;同时发现PASMCs随低氧程度增加增殖越明显,而AASMCs增殖的变化不明显。本实验提示PA和AA对低氧反应差异除了和低氧有关系外,可能和其所处的微环境有关系。2、PASMCs和AASMCs分别与ATII和RLE-6TN共培养,发现常氧条件下,ATII没有明显促进PASMCs和AASMCs增殖,RLE-6TN抑制PASMCs和AASMCs增殖;低氧条件下,ATII和RLE-6TN均明显促进了PASMCs和AASMCs增殖。3、ATII常氧培养上清液对常氧条件下培养的PASMCs和AASMCs增殖影响不明显;RLE-6TN常氧培养上清液抑制常氧条件下培养的PASMCs和AASMCs增殖。ATII和RLE-6TN常氧培养上清对低氧条件下培养的PASMCs和AASMCs增殖影响不明显;ATII和RLE-6TN低氧培养上清液既能促进常氧条件下培养的PASMCs和AASMCs增殖,也能促进低氧条件下培养的PASMCs和AASMCs增殖。4、ATII和RLE-6TN常氧培养上清液对常氧和HPH大鼠离体PA和AA收缩的影响不明显,ATII和RLE-6TN低氧培养上清液促进常氧和HPH大鼠离体PA和AA收缩。5、ATII不同氧浓度下培养48h测序结果及QT-PCR结果显示,与常氧组比,低氧促进肺泡上皮细胞SOD_2表达,对CAT表达影响不明显;商业试剂盒及流式细胞术检测结果显示,低氧ATII内总SOD含量和活力、总ROS及H_2O_2含量是增加的,ATII培养液中H_2O_2含量也是增加的。6、观察不同剂量外源性H_2O_2对PASMCs和AASMCs增殖情况,MTT结果显示,0μM到50μM H_2O_2促PASMCs增殖,呈现剂量依赖性,而100μM到1000μM H_2O_2随着剂量增加,逐渐抑制PASMCs增殖。0μM到100μM H_2O_2促进AASMCs增殖,呈现剂量依赖性,而200μM到1000μM H_2O_2随着剂量增加,逐渐抑制AASMCs增殖。其中50μM H_2O_2促PASMCs增殖最明显,100μM H_2O_2促AASMCs增殖最明显。在此浓度条件下,加入5 mM和10 mM NAC都能有效抑制H_2O_2诱导PASMCs和AASMCs增殖,10 mM NAC作用更明显。7、观察不同剂量外源性H_2O_2对PA和AA收缩情况,血管环实验结果发现,5μM到400μM H_2O_2随着剂量增加,促进PA收缩;从600μM到1000μM H_2O_2随着剂量增加,逐渐抑制PA收缩。5μM到600μM H_2O_2随着剂量增加,促进AA收缩;从800μM到1000μM H_2O_2随着剂量增加,逐渐抑制AA收缩。其中400μM H_2O_2促PA收缩最明显,600μM H_2O_2促AA收缩最明显。在此浓度条件下,加入5 mM和10 mM NAC都能有效抑制H_2O_2诱导PA和AA收缩,10 mM NAC作用更明显。8、ATII培养液中H_2O_2含量在促进PASMCs和AASMCs增殖范围内,也在促进PA和AA收缩范围内。选择10 mM NAC,加到PASMCs和AASMCs与ATII和RLE-6TN低氧共培养的培养液中,明显抑制PASMCs和AASMCs增殖。选择10 mM NAC,加入到含有低氧ATII和RLE-6TN培养上清液浴槽中,明显抑制PA和AA收缩。
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R544.1

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