应激性皮质激素诱导线粒体Mfn2泛素化降解介导的心肌肥大机制研究

发布时间：2020-05-26 06:40

【摘要】：流行病学研究发现,胎儿发育期子宫环境不良会导致成年期患心肌肥大、高血压、Ⅱ型糖尿病及认知障碍等一系列严重疾病的易感性增加。妇女在怀孕期间容易出现焦虑、抑郁等情志应激状态。孕妇在产前应激的状态下会释放大量糖皮质激素,通过胎盘屏障进入胎儿血液循环,严重影响子宫内胚胎发育。本课题组前期研究中,采用应激激素皮质酮(Corticosterone,CORT)作用于鸡胚来模拟孕妇产前应激状态,结果发现皮质激素能够诱导鸡胚心脏心肌肥大。然而,关于CORT是如何引起心肌肥大的具体机制尚不明确。因此,本研究在前期工作基础上,采用CORT负荷鸡胚模型和H9C2心肌细胞模型,深入研究情志应激诱导胚胎心肌肥大的分子生物学机制。首先,我们采用CORT构建了H9C2心肌细胞肥大的细胞模型,并通过检测肥大相关基因表达及细胞形态变化来验证此模型的有效性。实验结果显示,200μM的CORT处理H9C2细胞48 h后,肥大相关基因心房利钠因子相关肽(ANP)及B型利钠肽(BNP)的表达明显增加,且伴有细胞横截面积增大,肌节化增多等形态特征。同时,我们使用Mitored tracker检测H9C2细胞线粒体形态发现,CORT处理组线粒体网状结构发生紊乱,且呈短碎状聚集在核周围。进一步的透射电镜观察发现,H9C2细胞CORT处理组线粒体基质颜色加深,嵴结构肿涨,边界模糊不清,明显短小。此外,通过检测与线粒体功能相关的指标,我们发现CORT能够引起线粒体复合物酶Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ酶活性降低,MDA水平增加,ATP含量减少。以上研究结果表明,CORT诱导心肌肥大的原因可能与线粒体结构及功能损伤有关。Mfn2是线粒体融合过程中的关键蛋白,在维持线粒体正常网状结构中起重要作用。前期研究中我们发现,Mfn2蛋白表达在CORT应激诱导的鸡胚心肌肥大模型中明显异常,可能与该心肌肥大模型的机制有关。本研究系统考察了CORT对Mfn2蛋白表达水平的影响。结果发现,H9C2细胞及鸡胚心脏组织在CORT作用下Mfn2蛋白表达增加。但对Mfn2的细胞器定位研究发现,CORT作用下线粒体中Mfn2蛋白表达均明显减少,而内质网中Mfn2蛋白表达增加。同时,我们还利用蛋白合成抑制剂CHX抑制蛋白合成途径而蛋白降解途径开放,结果发现CORT可以加快线粒体Mfn2蛋白的降解速率,因此我们推测线粒体上的Mfn2蛋白可能发生了降解。目前蛋白质降解的途径主要包括泛素-蛋白酶体途径及溶酶体自噬途径。我们采用蛋白酶体降解抑制剂MG132和自噬抑制剂3-MA预保护进行比较研究发现,自噬抑制剂并不能恢复CORT引起的线粒体Mfn2蛋白减少,因此我们推测线粒体上Mfn2可能发生了泛素化降解。我们进一步对线粒体及内质网上Mfn2的泛素化水平进行检测,结果发现线粒体上Mfn2泛素化水平增加,而内质网上Mfn2泛素化水平无明显变化。本研究接下来进一步研究线粒体上Mfn2泛素化降解的发生机制。泛素-蛋白酶体系统的激活需要E3连接酶特异性识别底物分子中暴露的Lys位点,当底物蛋白空间构象发生变化时,就可能引起泛素化作用的激活。因此,我们推测线粒体中可能存在某种内质网中没有的特异性蛋白,能与线粒体上的Mfn2相互作用,从而使线粒体上Mfn2被泛素标记,引起线粒体与内质网中Mfn2泛素化水平的差异。为了进一步探究线粒体中可能存在的与Mfn2相互作用的特异性蛋白,我们通过NCBI Protein数据库筛选出了潜在作用蛋白,并用CELLO亚细胞器定位系统对这些蛋白进行亚细胞器定位预测,结果发现SLC25A38(Appoptosin)蛋白能够与Mfn2相互作用,且只分布在线粒体上而几乎不存在于内质网中。通过Western blotting、免疫共沉淀(CO-immunoprecipitation,CO-IP)及免疫荧光共聚焦共定位等技术我们发现,CORT显著增加Appoptosin的蛋白表达水平,促进Mfn2与Appoptosin蛋白之间的相互作用。采用小RNA干扰技术沉默Appoptosin表达后,CORT处理组线粒体Mfn2的表达水平明显上调而线粒体Mfn2泛素化水平显著下降,伴随线粒体复合物酶活性及ATP含量增加及肥大相关基因表达下调。以上结果提示,CORT引起线粒体Mfn2的泛素化降解是通过Appoptosin介导的。综合以上,CORT能够诱导心肌细胞发生肥大并伴随线粒体呼吸链复合物活性降低,线粒体呈点状断裂,基质颜色加深,嵴结构肿涨。同时,CORT能够诱导线粒体蛋白Appoptosin的表达水平上调,促进Mfn2与Appoptosin之间的相互结合,导致线粒体Mfn2泛素化水平增加,线粒体Mfn2蛋白表达减少;而沉默Appoptosin能够改善CORT诱导的线粒体Mfn2蛋白减少、线粒体损伤及心肌肥大。证明CORT是通过调控Appoptosin介导的线粒体Mfn2泛素化从而导致线粒体结构及功能损伤,最终引起心肌肥大。
【图文】：

示意图,心肌肥大,横截面,示意图

[17]。如图1所示，心肌肥大按照心室壁厚度及心室腔容积可分为离心性肥大（Eccentrichypertrophy）和向心性肥大（Concentric hypertrophy），当心脏长期处于容量超负荷状态时，就会表现为心脏重量增加，心室腔扩大，心室壁变薄，心肌细胞伸长的离心性肥大表型。当心脏发生向心性肥大时，其心肌细胞间质网络密度及心室壁厚度增加而左心室腔容积减少[18, 19]。事实上，心肌肥大在发展初期是机体为了补偿内部代谢失调引起的心功能动力不足而发生的自身适应性心肌重塑反应，这种代偿性的肥大能够增加心脏收缩单元数量、降低心室壁应力，被认为对机体是有益的[20]。但是长期的代偿性反应将引起心脏收缩功能失调、间质纤维化、基因表达及电生理特征异常

皮质酮,心肌肥大,心肌细胞

图 2 皮质酮对鸡胚心脏的影响[37]体与心肌肥大知，心脏是一个高耗能器官，人体心脏每天需消耗大概 6 kg）以维持机体正常活动。但心肌细胞对 ATP 的储存能力较低且足心脏长时间收缩舒张所需的能量，因此心肌必须不断产生常功能[21]。线粒体被称为“细胞发电厂”，占心肌细胞体积的胞中 90%以上 ATP 来自线粒体氧化磷酸化，，只有小部分依靠线粒体功能稳态对于维持心肌能量代谢具有重要意义[38]。在体通过脂肪酸氧化产生的 ATP 足以满足机体化学能量动态需处于心肌肥大状态时，其能量产生模式会由脂肪酸 β 氧化转变脏供能不足，最终导致心肌肥大[39, 40]。同时，参与脂肪酸代谢
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R542.2

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