缺锌对心肌细胞内质网和线粒体的影响及机制

发布时间：2020-05-26 18:47

【摘要】：目的探讨缺锌对于心肌细胞内质网和线粒体的影响,以阐明缺锌引起心肌细胞损伤的信号通路及机制。方法1选取大鼠胚胎心脏组织来源的H9c2细胞为实验对象,应用锌离子(Zn~(2+))螯合剂四吡啶甲基乙二胺(N,N,N',N'-tetrakis Ethylenediamine,TPEN)建立缺锌模型。线粒体荧光探针TMRE(100 nM)预染细胞,激光扫描共聚焦显微镜观察TPEN对线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,?Ψm)的影响,进而判断线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)的开放情况;应用Western blot法检测结合免疫球蛋白(binding immunoglobulin protein,BIP),最终确定TPEN的最适浓度。2 Western blot法检测TPEN对内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)伴侣BIP和葡萄糖调节蛋白94(glucose regulated protein,GRP 94)的影响,观察外源性锌(ZnCl_2)能否抑制此作用。3观察缺锌对ERS感受器肌醇需酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)表达的影响。4观察IRE1抑制剂STF083010对IRE1表达的影响以确定最适浓度。5观察STF083010是否抑制缺锌引起的IRE1表达。6激光扫描共聚焦显微镜观察TPEN对内质网红色荧光探针ER Tracker荧光强度的影响。7观察TPEN对线粒体红色荧光探针TMRE荧光强度的影响。8应用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒检测细胞毒性。结果1不同浓度(0.01、0.1、1、10、100μM)TPEN处理H9c2细胞20 min,与对照组(100.0±4.1%)相比,1、10、100μM TPEN使TMRE红色荧光强度明显减弱,100μM TPEN使荧光强度减弱最为明显,10μM TPEN对TMRE荧光强度影响较小(67.8±2.3%),差异具有统计学意义(P0.05),说明缺锌能够引起线粒体膜电位降低,即诱导mPTP开放;Western blot结果显示,与正常对照组(100±3.8%)相比,10μM TPEN处理细胞20 min后使BIP的表达明显增加(210.2±7.7%),差异具有统计学意义(P0.05),说明缺锌引起ERS,后续实验TPEN浓度均采用10μM。2 Western blot结果显示,与正常对照组(100±2.2%)相比,TPEN处理20 min使BIP表达明显增加(215.1±8.3%),此作用被ZnCl_2所逆转(163.2±9.5%),差异具有统计学意义(P0.05);与正常对照组(100±3.9%)相比,TPEN处理20 min使GRP 94表达明显增加(194.1±6.2%),此作用同样被ZnCl_2所逆转(156.6±4.9%),差异具有统计学意义(P0.05),上述结果表明,缺锌引起ERS,补充外源性锌(5μM ZnCl_2)可以防止ERS。3 Western blot结果显示,与正常对照组(100±1.5%)相比,TPEN处理20min后,IRE1表达明显增加(188.4±3.9%),此作用被ZnCl_2所逆转(133.0±7.8%),差异具有统计学意义(P0.05),说明缺锌可能激活了IRE1。4不同浓度(0.1、1、5、10、30、45μM)STF083010处理H9c2细胞30 min后,与正常对照组(100±8.1%)相比,1μM STF083010处理细胞使IRE1表达明显降低(59.1±2.4%),差异具有统计学意义(P0.05),说明STF083010能够抑制IRE1的表达。后续实验STF083010浓度均采用1μM。5与正常对照组(100±3.8%)相比,TPEN处理20 min后,IRE1表达明显增加(204.2±7.3%),此作用被STF083010所逆转(152.2±3.3%),差异具有统计学意义(P0.05),进一步说明缺锌激活了IRE1。6与对照组(100.00?3.0)相比,TPEN使ER Tracker红色荧光强度明显减少(59.15?3.2),STF083010明显抑制TPEN引起的红色荧光强度的减少(79.4±3.8%),差异具有统计学意义(P0.05),说明缺锌通过IRE1导致内质网损伤。7与对照组(100.00?4.5)相比,TPEN使TMRE红色荧光强度明显减少(61.35?2.7),STF083010明显抑制TPEN引起的TMRE荧光强度的减少(79.6±2.2%),差异具有统计学意义(P0.05),说明缺锌通过IRE1导致mPTP开放。8 LDH细胞毒性试剂盒检测结果显示,与对照组(100.00?0.0)相比,TPEN使细胞毒性明显增加(195.17?7.4),STF083010明显抑制TPEN产生的细胞毒性(150.0±4.0%),差异具有统计学意义(P0.05),说明缺锌通过IRE1使细胞毒性增加。结论缺锌引起内质网应激,通过感受器IRE1导致mPTP开放,使细胞毒性增加,最终导致心肌细胞受损。补充外源性锌可以抑制内质网应激,保护心肌细胞。图11幅;表10个;参172篇。
【图文】：

标准曲线,标准曲线,工作液,硕士学位论文

华北理工大学硕士学位论文表 1 蛋白定量体积表Table 1 Protein quantitative volume tableA B C D E F G 标准蛋白（μl）0 1 2 4 8 12 16 PBS（μl） 20 19 18 16 12 8 4 BCA 工作液（μl）200 200 200 200 200 200 200 待测蛋白（μl）2 2 2 2 2 2 2 PBS（μl） 18 18 18 18 18 18 18 BCA 工作液（μl）200 200 200 200 200 200 200

膜电位,缺锌,细胞损伤,最适浓度

- 15 -注：*P<0.05 vs. Baseline图 2 TPEN 对线粒体膜电位（mPTP 开放）的影响Fig.2 Effect of TPEN on mitochondrial membrane potential（mPTP opening）1.2.2 Western blot 观察缺锌对 BIP 的影响为了探究 TPEN 造成细胞损伤的最适浓度，实验中我们用 Western blot 法检测BIP 蛋白表达，结果显示，与正常对照组（100±3.8%）相比，10 μM TPEN 处理细胞 20 min 后使 BIP 的表达明显增加（210.2±7.7%），，差异具有统计学意义（P＜0.05），说明缺锌引起 ERS，如表 3、图 3 所示，因此后续实验 TPEN 浓度采用10 μM。
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R54

【参考文献】