Rab6对低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞表型转化的影响

发布时间：2020-05-27 04:40

【摘要】：背景和目的:肺动脉高压(Pulmonary Arteria Hypertension,PAH)是一种由多因素引起的肺血管功能及结构异常,导致肺血管阻力增加,引起肺动脉压异常升高的临床综合征。低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hyper-tension,HPH)由急性或慢性肺泡缺氧所致,能导致右心肥大及右心功能不全,最终导致不可逆的右心衰竭。HPH是许多心肺疾病的重要发病机制之一,如慢性阻塞性肺疾病、慢性肺源性心脏病和慢性高原病等。目前针对HPH的治疗仍以原发病的治疗为主,而存在的一些治疗手段如血管扩张药物,氧疗,靶向药物等不能有效控制HPH的进展。因此,研究HPH的发病机理,对防治和治疗与其相关的心肺疾病具有重要的临床意义。肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)是构成肺动脉壁的主要细胞,位于血管壁的中层,能够维持血管结构的完整性和介导对低氧的反应,与HPH的发生发展密切相关。PASMCs其分化呈可逆状态并且具有较强的可塑性,这与骨骼肌和心肌细胞不同。人们根据其功能和结构不同,将其分为收缩型(分化型)和合成型(未分化型)两种。PASMCs受到多种因素的刺激时会发生表型转化,即从有收缩功能的分化表型转化为有较强增殖和迁移能力的去分化表型,但由于表型转化是一个渐进的过程,所以大量过渡的中间型可存在于同一血管壁中。近年来,有研究表明,低氧可以诱导PASMCs表型转化,但发生的具体机制不清楚。细胞内各细胞器之间的转运对于细胞存活至关重要,受Ras样超家族成员的调节。这个超家族包括Ras、Rho、Arf、Ran和Rab亚家族。Rab蛋白作为最大的家族成员,由约200个氨基酸组成,蛋白相对分子量约20 000-29 000Da,各成员之间有相似的结构和功能。目前已经发现有60多种Rab蛋白在人类中表达,几乎存在于所有与膜有关的真核细胞的细胞器中,在不同的膜上有不同的Rab蛋白,每个细胞器中至少一个或多个Rab蛋白。细胞内膜腔之间的运输分为囊泡的形成、转运、粘附、锚定和融合,而Rab蛋白作为囊泡运输的分子开关,在各个阶段都起到了作用。Rab6作为Rab蛋白家族的成员之一,主要存在于高尔基体上,能参与调节多种蛋白在细胞膜上的转运,同时影响内质网的折叠环境。近期有研究表明,内质网应激也可以调节表型转化。因此,在低氧引起表型转化和内质网应激的过程中,Rab6能否通过对内质网应激的调控来影响PASMCs发生表型转化需要进一步的研究。综上所述,本研究的目的是研究Rab6是否通过内质网应激调控低氧诱导的大鼠PASMCs的表型转化,并探讨其在低氧过程中对内质网应激的作用。方法:1、将大鼠肺动脉平滑肌细胞(rat pulmonary arterial smooth muscle cells,RPASMCs)分为低氧(1%02)Oh组和低氧12h、24h、48h组,采用蛋白质印迹法(Western Blot,WB)检测α-SMA、VIM、Rab6和内质网应激相关分子GRP78的定量变化和免疫荧光检测α-SMA、VIM和GRP78定位变化。2、应用荧光显微镜观察RPASMCs转染Cy3标记的siRNA的效率;实验设空白组,NC siRNA 组、Rab6 siRNA1 组、Rab6 siRNA2 组、Rab6 siRNA3 组,应用逆转录-多聚酶链反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)和 WB 检测 mRNA 和目的蛋白的抑制率。3、利用Rab6 siRNA沉默RPASMCs中Rab6的表达后低氧培养,应用WB和免疫荧光检测RPASMCs表型转化标志分子α-SMA、VIM和内质网应激相关分子GRP78的定量和定位变化。结果:1、与低氧Oh组比较,RPASMCs经1%O2低氧处理12h、24h和48h后,低氧48h后表型标志基因蛋白α-SMA的表达下调,VIM的表达上调;Rab6表达上调;RPASMCs经低氧处理12h后,内质网应激相关分子GRP78表达上升最明显。2、Rab6 siRNA能够成功转染至RPASMCs中,并且显著抑制了 RPASMCs中Rab6的表达。3、与低氧NC siRNA比较,低氧转染Rab6 siRNA后,RPASMCs中表型标志基因蛋白α-SMA的表达上调,VIM的表达下调;内质网应激相关分子GRP78表达下调。结论:1、低氧能促进RPASMCs表型转化和内质网应激,且内质网应激比表型转化更早发生。2、Rab6参与了低氧诱导的RPASMCs表型转化和内质网应激过程。
【图文】：

图２－１－１低氧对ＲＰＡＳＭＣｓ中表型标志蛋白表达的影响逡逑Ａ．逦ＷＢ捡测低氧处理ＲＰＡＳＭＣｓ后不同时间点表型标志蛋白ａ－ＳＢ．表型标志蛋白ａ－ＳＭＡ和ＶＩＭ的表达情况的半定量分析（与Ｏｈ２．１．２．２低氧处理不同时间点对ＲＰＡＳＭＣｓ中表型标志蛋白免疫荧光结果显示，常氧状态下，细胞呈长梭形，２４ｈ、４８ｈ处理后与低氧Ｏｈ组对比，细胞形态发生改变肌丝减少，荧光逐渐减弱，ａ－ＳＭＡ在胞浆内表达减１２ｈ、２４ｈ、４８ｈ处理后与低氧Ｏｈ组对比，荧光逐渐增胞内定位无改变（图２－１－２Ａ，，邋Ｂ）。逡逑

图２－１－２低氧对ＲＰＡＳＭＣｓ中表型标志蛋白定位及表达的影响逡逑（绿色荧光标记蛋白，蓝色标记ＤＡＰＩ染色的细胞核）逡逑Ａ．免疫荧光检测低氧对ＲＰＡＳＭＣｓ中ｃｔ－ＳＭＡ的影响。放大率：１０００倍。逡逑Ｂ．免疫荧光检测低氧对ＲＰＡＳＭＣｓ中ＶＩＭ的影响。放大率：１０００倍。逡逑
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R544.1

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本文编号：2682963