腺病毒介导的B区缺失的人凝血因子Ⅷ在SD大鼠ADSCs中的表达

发布时间：2020-05-27 06:46

【摘要】：目的旨在探究ADSCs作为血友病A基因治疗靶细胞的可能性,将一含B区缺失的人凝血因子Ⅷ基因(B-domain deleted human coagulant factorⅧ,BDDhFⅧ)的重组腺病毒载体体外感染SD(Sprague Dawley,SD)大鼠脂肪干细胞(adipose tissue-derived stem cells,ADSCs)。方法1细胞培养与鉴定:无菌条件下采用胶原酶消化法取SD大鼠两侧腹股沟脂肪组织并分离培养ADSCs,传至P3代用MTT法检测细胞生长曲线;流式细胞仪检测细胞表面标志;成骨/成脂诱导剂检测干细胞多向分化潜能。2实验分组:A组为Ad-BDDhFⅧ-GFP感染ADSCs组,B组为Ad-GFP感染ADSCs组,C组为正常培养ADSCs组;3采用CCK-8法检测三组感染后细胞生长情况,ELISA法检测细胞上清中FⅧ抗原表达水平,RT-PCR及Western blot分别检测感染后三组细胞内BDDhFⅧ基因和蛋白表达情况。结果1经鉴定分离培养的P3代细胞呈螺旋状、梭型排列,MTT法检测其生长曲线呈倒“S”形;流式细胞学检测P3代细胞CD29(99.05%)、CD90(97.82%)、CD44(92.41%)阳性表达,CD45(8.38%)阴性表达;经成脂诱导14d后,Oil Red O染色呈阳性;成骨诱导7d后ALP染色呈深蓝色,成骨诱导30d后,茜素红染色提示矿化结节。2重组腺病毒载体Ad-BDDhFⅧ-GFP感染ADSCs24h后可见绿色荧光,72h荧光表达强度最强,最佳MOI为350。3 CCK-8检测感染后三组对细胞仍呈倒“S”曲线生长。4 ELISA结果显示三组感染ADSCs72h后,A组hFⅧAg表达(140.26±2.29)明显高于B组(99.95±1.05)与C组(80.02±0.21),差异具有统计学意义(P0.05)。5 RT-PCR结果显示:三组感染ADSCs后72hA组有BDDhFⅧ基因表达;B、C组无BDDhFⅧ基因表达。6Western blot检测示三组感染ADSCs72h后,A组hFⅧ蛋白表达(1.10±0.57)明显高于B组(0.60±0.20)与C组(0.33±0.12),差异具有统计学意义(P0.05)。结论1腺病毒携带的B区结构域缺失的人凝血因子Ⅷ基因载体可成功感染SD大鼠ADSC。2感染后的细胞能够有效的表达人凝血因子FⅧ。图9幅;表4个;参61篇。
【图文】：

图 1 倒置显微镜下 ADSCs 的形态（×100）A：原代培养 48h；B：原代培养 7d；C：3 代ADSCsFig.1 Morphology of cultured ADSCs(Inverted microscope, ×100). A: Primary culture at 48hours; B:Primary culture at 7 days; C: Third Generation culture.

图 2 第三代 ADSCs 生长曲线Fig.2 Growth curve of third generation ADSCs.检测 ADSCs 表面标志：P1 代细胞 CD45 表达阴性为 1.29%，CD90、C
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R554.1

【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 王诗轩;杨仁池;;血友病A抑制物研究进展[J];中华血液学杂志;2017年05期

2 燕玲;曾小菁;;血友病基因治疗进展[J];中国实验血液学杂志;2015年01期

3 马洪斌;李运祥;王铭伦;;腺病毒携带骨形态发生蛋白14基因转染脂肪干细胞修复损伤关节软骨[J];中国组织工程研究;2015年01期

4 袁福康;陆信武;秦金保;彭智猷;叶开创;杨芯蕊;黄丽佳;蒋米尔;;绿色荧光蛋白转基因小鼠脂肪干细胞治疗后肢缺血的实验研究[J];中国血管外科杂志(电子版);2014年04期

5 李艳杰;陈，

本文编号：2683128