FABP5参与Raw264.7细胞氧化LDL的初步研究

发布时间：2020-06-17 18:18

【摘要】：目的:动脉粥样硬化(AS)被认为是一种慢性炎症反应,是由于超过体内正常标准的过高的氧化型的低密度脂蛋白(Ox-LDL)被巨噬细胞摄取后变为泡沫细胞引起强烈的AS效应。本研究利用LDL刺激RAW264.7细胞后,测定细胞中磷脂酶A2(PLA2)的生物活性,利用Real-time PCR和Western bolt技术测定细胞中脂肪酸结合蛋白5(FABP5)和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)的表达含量,探究它们在转录和翻译水平的变化。同时,利用不饱和脂肪酸(UFAs)包括油酸(OA)、亚油酸(ALA)、花生四烯酸(AA)刺激RAW264.7细胞后测定FABP5的表达水平,旨在探究UFAs与FABP5之间是否存在互相作用关系。利用以上的实验结果推测PLA2,UFAs,FABP5和PPARs在LDL氧化中的相互作用,为LDL氧化提供新的思路,为临床疾病的诊治指明方向。方法:用LDL刺激RAW264.7细胞不同时间,用PLA2总活性光度法定量检测试剂盒测定细胞内PLA2活性变化;LDL对RAW264.7细胞进行不同的长时间的刺激后利用Real-time PCR及Western blot技术测定FABP5基因和蛋白变化的水平,利用Real-time PCR技术检测PPARs的转录水平变化;利用梯度离心法把细胞中提取蛋白进行分离后提取脂质筏和非脂质筏对其中的FABP5蛋白含量进行测定,探究FABP5在细胞脂质筏和非脂质筏之间的的转位;培养RAW264.7细胞,利用UFAs中的不同浓度的OA、ALA、AA刺激后利用Western bolt技术检测细胞FABP5蛋白表达水平。结果:LDL短时间刺激小鼠RAW264.7细胞后,结果表明PLA2活性升高;LDL刺激RAW264.7细胞较长时间后,FABP5的mRNA和蛋白表达含量均比对照组上升;提取脂质筏后发现,LDL刺激15 min的巨噬细胞的脂筏中FABP5的含量较对照组的升高,而非脂筏部分则出现相反的结果。利用不同浓度的OA,ALA,AA长时间刺激RAW264.7细胞,OA刺激细胞12 h后,FABP5的表达量出现升高的趋势,ALA刺激细胞5h、12 h后FABP5的表达量均上升,AA刺激细胞后FABP5的表达含量出现升高趋向;对PPARs的研究发现,LDL刺激后,PPAR α无明显表达,PPAR β和PPARγ的基因表达水平上升。结论:LDL刺激能提高PLA2活性,同时使FABP5表达升高并且发生了从非脂筏到脂筏的转位,说明FABP5、PLA2是LDL氧化过程中很重要的因子。UFAs刺激均能使FABP5的表达发生变化,说明UFAs可能是FABP5在此过程的下游结合分子。LDL刺激后PPARs在细胞内的基因表达水平出现上升的趋势。结合相关文献,我们对LDL的氧化过程做出推测:LDL刺激会激活PLA2,而PLA2水解甘油磷脂产生UFAs(OA、ALA、AA等),这些UFAs招募并结合FABP5作为配体与与PPARS特异性位点结合后,然后与目标基因上过氧化物媒体增值因子反应元件PPRE结合,激发氧化应激通路,促进LDL的氧化,并且这个过程可能与脂质筏相关。
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R543.5
【图文】：

利用ＰＬＡ２总活性光度法定量检测试剂盒测定细胞内ＰＬＡ２活性变化：刺激后酶逡逑的活性均增高，刺激７１１１丨１１后酶的活性增高大约两倍（０．００８６±０．０００３６５），刺激逡逑１５１１１丨１１后酶的活性增高大约１．５倍（０．０００６１士０．０００２８３）（图１）。逡逑０．０１０－１邋＊逡逑，逦0侧－逦＿W逡逑七邋0邋００６－逡逑｜邋０．００４－逡逑ｔ逡逑０－００２－逦Ｍｉ逡逑０邋０００１＾＾逡逑，，，逡逑ｔ／ｍｉｎ逡逑图１NＤＬ刺激Ｒａｗ２６４．７细胞０邋ｍｉｎ、７邋ｍｉｎ、１５邋ｍｉｎ后ＰＬＡ２活性变化图逡逑注：与对照组相比，＊ｐ＜０．０５，逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１邋ＰＬＡ２邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｉｎ邋Ｒａｗ２６４．７邋ｃｅｌｌｓ邋ａｆｔｅｒ邋ｔｈｅ邋ＬＤＬ邋ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ逡逑３．邋２邋ＬＤＬ刺激ＲＡＷ２６４．邋７细胞后ＦＡＢＰ５表达变化以及在脂筏内逡逑的转位情况逡逑３．邋２．１邋ＬＤＬ刺激ＲＡＷ２６４．邋７细胞后ＦＡＢＰ５表达变化逡逑利用浓度为１００呢／邋ｍＬ的ＬＤＬ诱导ＲＡＷ２６４．７细胞１邋ｈ、３邋ｈ、５邋ｈ后Ｒｅａｌ逡逑ｔｉｍｅ－ＰＣＲ检测ＦＡＢＰ５ｍＲＮＡ的表达水平（图２）。与对照组比较，ＬＤＬ刺激逡逑细胞邋ｌｈＦＡＢＰ５ｍＲＮＡ邋表达升高（１．７５２１±０．３１５邋７，Ｐ邋＜邋０．０５）；利用浓度为逡逑１００邋｜ａｇ／ｍＬ的ＬＤＬ刺激细胞１邋ｈ、３邋ｈ、５邋ｈ后，收集细胞利用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｏｌｔ技术逡逑分析细胞内ＦＡＢＰ５表达的情况

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【参考文献】

相关期刊论文 前5条

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本文编号：2717976