27nt-miRNA对血管内皮细胞管腔形成和鸡胚尿囊膜血管新生的影响及相关机制研究

发布时间：2020-06-17 22:35

【摘要】：目的本课题组前期研究提示,来源于内皮特异型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)第4内含子的27碱基重复序列的27nt-miRNA可负反馈调控其宿主基因eNOS的转录和蛋白表达。本研究拟通过慢病毒转染建立27nt-miRNA高表达的人脐静脉内皮细胞株(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),体外实验探究27nt-miRNA对HUVECs增殖、迁移和管腔形成的影响及分子机制;体内实验进一步探究27nt-miRNA对鸡胚绒毛尿囊膜(chicken chorioallantoic membrane,CAM)血管新生的影响,深入探讨27nt-miRNA在心血管系统发育和心血管疾病发生发展中的作用。方法1 HUVECs的培养及慢病毒转染委托上海吉凯基因化学技术有限公司根据相应的miRNA序列设计、构建27nt-miRNA、anti-27nt-miRNA及空白对照载体,经PCR鉴定及DNA测序比对分析确定载体构建成功后用慢病毒包装载体形成27nt-miRNA、anti-27nt-miRNA及对照慢病毒液。将慢病毒分别转染HUVECs后分为:27nt-miRNA高表达组、anti-27nt-miRNA组和对照组。荧光显微镜下观察细胞绿色荧光表达强度并采用流式细胞术检测细胞慢病毒转染效率确定27nt-miRNA细胞株建立情况。2 27nt-miRNA对HUVECs增殖、迁移和管腔形成的影响构建27nt-miRNA、anti-27nt-miRNA及对照载体并包装入慢病毒,分别转染HUVECs后分为27nt-miRNA组、anti-27nt-miRNA组和对照组,采用四甲基偶氮唑盐(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT)比色法检测各组细胞的增殖能力;采用划痕试验(Scratch test)检测各组细胞的迁移能力;采用人工基底胶(Matrigel)检测各组细胞的体外管腔形成能力。3 27nt-miRNA对转染后各组细胞eNOS及转录因子Sp1表达的影响构建27nt-miRNA过表达、anti-27nt-miRNA及对照载体并包装入慢病毒,分别转染HUVECs后分为:27nt-miRNA高表达组、anti-27nt-miRNA组和对照组,采用逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测eNOS及Sp1的mRNA表达水平;采用免疫细胞化学法(Immunocytochemistry)及免疫印迹试验(Western blotting)检测eNOS及Sp1的蛋白表达情况;采用一步法检测细胞及培养液中一氧化氮(nitric oxide,NO)的浓度。4探究27nt-miRNA对CAM血管新生的影响构建27nt-miRNA高表达、anti-27nt-miRNA及对照载体并包装入慢病毒,采用CAM模型转染相应慢病毒后分为:27nt-miRNA高表达组、anti-27nt-miRNA组和对照组,观测各组CAM血管面积占总CAM面积的百分比。结果1荧光显微镜下可见转染后的细胞绿色荧光较强,细胞状态良好,流式细胞术结果表明27nt-miRNA高表达组、anti-27nt-miRNA组和空白对照组的慢病毒转染效率均达到90%以上,细胞株构建成功。2与对照组比较,27nt-miRNA组HUVECs增殖活性明显下降(P0.05),迁移率降低(P0.05),且未见明显管腔样结构形成。3与对照组相比,27nt-miRNA组HUVECs内eNOS和Sp1的mRNA(P0.05)与蛋白表达明显降低(P0.05),NO产量下降(P0.05)。4相比对照组,27nt-miRNA组的CAM血管新生面积降低(P0.05)。结论1 27nt-miRNA显著抑制体外HUVECs增殖、迁移和成管能力。2 27nt-miRNA显著抑制HUVECs的eNOS和Sp1的mRNA和蛋白表达,27nt-miRNA可能协同Sp1调控eNOS的表达进而影响HUVECs的细胞功能,包括增殖、迁移和成管能力。3 27nt-miRNA显著抑制CAM血管新生。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R54
【图文】：

序列即 27nt-miRNA 的序列：5′-GAAG-3′、27nt-miRNA 反义序列及随机对AGACGAG-3′分别设计 27nt-miRNA、用 PCR 技术获取目的基因，通过基因基因分别克隆到 GV367 载体中，载体GFP-IRES-puromycin）如图 1-1，其中7nt-miRNA、对照序列），接着 PCR 及用慢病毒包装相应 GV367 载体形成照慢病毒。GV367 载体含增强绿色荧光rotein, EGFP）标记及嘌呤霉素抗性（达 EGFP，发出绿色荧光，同时，可用。

2019 届硕士学位论文 27nt-miRNA 对 HUVECs 管腔形成和 CAM 血管新生的影响及相关机制研究3 结果3.1 镜下观察 HUVECs 形态及慢病毒转染情况正常 HUVECs 的生长状态良好，镜下呈椭圆或多角形，部分为短梭型，如铺路石样单层排列。刚复苏的细胞贴壁存活率不高且生长速度较缓慢，随着生长环境的改善，细胞的生长速度加快，达到 90%的密度后，细胞体积缩小，边缘较亮，形态为椭圆形或圆形。慢病毒转染 48 h 后用嘌呤霉素筛选，转染 72 h 后在荧光显微镜下可见细胞产生较强的绿色荧光，转染效率较高，转染后细胞状态未受影响，结果如图 1-2。

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本文编号：2718256