经典型蛋白激酶C亚型对低氧诱导的小鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响及机制探讨

发布时间：2020-06-18 09:26

【摘要】：目的:肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的过度增殖是低氧性肺动脉高压(HPH)所致肺血管重塑的基础病理变化,特别是远端肺小动脉的结构改变对HPH的发生发展具有重要意义。而低氧、多种生长因子等因素通过细胞内信号转导通路参与了细胞异常增殖过程的启动和调控。探明其病理发生机制,找到可能逆转HPH所致血管重塑的治疗靶点意义重大。近年来,基于蛋白激酶转导通路的调控受到广泛关注。在对蛋白激酶的相关研究中,发现经典型蛋白激酶C(cPKC)与低氧诱导的PASMCs异常增殖和HPH可能相关。此外,随着小鼠基因动物模型应用于肺动脉高压疾病研究,建立稳定的小鼠远端PASMCs原代培养技术是细胞分子水平实验研究的基础。那么,关于cPKC各亚型是否参与和调控低氧诱导下的PASMCs异常增殖?目前尚不清楚。鉴于以上背景,本实验主要研究:1.借鉴国外的PASMCs磁性分离培养方法,并加以改良,探讨建立稳定的小鼠远端PASMCs原代培养技术。2.利用原代培养的小鼠远端PASMCs建立低氧模型,探讨低氧对PASMCs增殖及cPKC各亚型表达的影响。3.通过药物干预或病毒转染体外原代培养的小鼠远端PASMCs,探讨cPKC特定亚型对低氧诱导的细胞增殖及ERK1/2、Akt表达的影响。方法:1.利用Dynal MPC-1磁分离器分离含铁粉的远端肺小动脉血管,进行细胞的原代培养;显微镜下观察细胞形态,并通过平滑肌细胞smoothelin多克隆抗体和myosin heavy chain多克隆抗体对培养的细胞进行免疫荧光双染色法鉴定。2.用cPKC各亚型特异性抗体,采用免疫印迹、免疫荧光技术鉴定cPKC各亚型在正常小鼠PASMCs上的表达情况。3.对正常小鼠PASMCs进行低氧(O_2浓度3%)培养,建立细胞缺氧模型。4.采用CCK法和Brdu法检测常氧和低氧条件下细胞增殖能力变化。5.采用免疫荧光技术、免疫印迹技术、间接免疫荧光流式细胞技术检测常氧和低氧条件下不同时相点cPKC亚型蛋白表达变化。6.应用PKC激动剂(PMA)、PKCα抑制剂(safingol)、PKCβI抑制剂(Go6976)、PKCβII抑制剂(LY333531)分别干预细胞后,在常氧和低氧条件下,采用免疫印迹法观察cPKC亚型蛋白表达变化,以及ERK1/2、Akt磷酸化水平变化。7.应用PKCα、PKCβ的慢病毒载体,通过病毒转染技术特异性敲减目标基因活性,采用免疫印迹法观察低氧诱导小鼠PASMCs中cPKC亚型蛋白表达变化,以及ERK1/2、Akt磷酸化水平变化。结果:1.经细胞形态学、平滑肌细胞标记物smoothelin和myosin heavy chain免疫荧光鉴定,证实从小鼠远端肺动脉原代培养的细胞是平滑肌细胞。2.经改良后,采用磁分离原理对小鼠远端PASMCs进行分离和原代培养技术具有操作难度低、重复性好的特点,并能获得稳定的高纯度小鼠PASMCs系。3.通过免疫印迹技术、免疫荧光技术,均检测到cPKCα(75 kDa)、cPKCβI(77 kDa)和cPKCβII(77 kDa)在小鼠PASMCs中表达,而cPKCγ(78 kDa)没有检测到。4.采用CCK法和Brdu法,检测到经低氧和常氧培养24h、48h、72h后,小鼠PASMCs中的CCK吸光度值和Brdu阳性细胞率均较常氧组显著增高,其中低氧72h时相点细胞的增殖能力提高最明显。5.采用免疫荧光技术定性分析,发现经低氧培养24h、48h、72h后,cPKCα的蛋白表达较常氧组均明显增高;cPKCβI、βII的蛋白表达在低氧培养48h、72h后均高于常氧组。6.采用免疫印迹技术、流式细胞技术的定量分析,均检测到cPKCα、βI、βII的蛋白表达在低氧培养24h、48h、72h各时相点明显高于常氧组。7.采用Brdu法,检测到用safingol、Go6976、LY333531分别抑制cPKCα、βI和βII时,低氧诱导的PASMCs增殖能力受到明显抑制,我们还观察到PMA在常氧条件下可显著促进PASMCs的增殖能力;此外经过PKCα、PKCβ的慢病毒载体转染细胞后,也发现低氧转染组的PASMCs增殖能力较空载对照组明显下降。8.通过免疫印迹技术还观察到,用safingol、Go6976、LY333531分别抑制cPKCα、βI和βII表达后,低氧诱导的PASMCs中ERK1/2、Akt的磷酸化水平较对照组显著降低,PMA可使常氧条件下PASMCs中ERK1/2、Akt的磷酸化水平增高;我们还利用病毒转染技术对cPKCα、β的表达进行特异性敲减,发现低氧条件下,转染细胞后均可使细胞中ERK1/2磷酸化水平显著降低,而Akt磷酸化水平较对照组无明显变化。结论:1.本实验通过改良后的磁性分离方法成功的进行了小鼠远端PASMCs的原代培养,获得的细胞纯度及存活率高,可用于下一步实验。解决了远端肺小动脉取材困难的难点,该方法可操作性强,重复性好。2.本实验验证了低氧可诱导小鼠远端PASMCs的过度增殖。3.验证了在小鼠PASMCs上存在cPKCα、cPKCβI和cPKCβII的表达,而没有cPKCγ的表达。4.低氧可上调小鼠远端PASMCs中cPKCα、cPKCβI和cPKCβII的蛋白表达,低氧诱导小鼠远端PASMCs的异常增殖可能是通过上调cPKCα、βI和βII信号通路来调控的。5.药物干预或者病毒转染可使PASMCs中cPKCα、βI和βII表达下降,可显著抑制低氧诱导的小鼠远端PASMCs异常增殖,其作用机制可能与cPKCα、βI和βII蛋白表达上调有关。6.低氧可能通过上调cPKCα、βI和βII的蛋白表达,使得ERK1/2磷酸化水平增高,最终引起小鼠远端PASMCs的异常增殖,参与HPH的形成过程。7.调控cPKCα、βI和βII的表达可能有利于改善肺血管重塑的形成,基于cPKC亚型的靶向治疗可望成为今后HPH治疗的新方向。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R544.1
【图文】：

远端,右心室,肺部,培养皿

8①在小鼠腹部偏左侧做切口；②暴露肾脏，剪断肾动脉除血；③沿胸骨左侧剪开胸骨，充分暴露胸腔；④PBS 液经右心室注入灌洗右心室、肺动脉除血；⑤肺部外观呈白色；⑥暴露气管，下穿手术缝合线，将留置针插入气管，结扎固定；⑦PAAgarose 液经右心室注入右心室、肺动脉；⑧肺部外观呈灰色；⑨经气管留置针，Lung Agarose 液注入肺部。图 1 远端肺动脉血管的制备1.2.2 PASMCs 的原代培养第 1 天：(1) 超净工作台上，将取下的心肺组织置于 60mm 培养皿中分离除去心脏、胸腺、气管等邻近组织，然后用无菌的 PBS 液漂洗肺组织，直至凝血洗净；(2) 更换培养皿后，加入 1ml 无菌预冷后的 PBS 液，用手术刀将肺组织碎化为1~2mm 组织块。然后用移液管反复抽吸吹打组织块，移入 50ml 的无菌离心管中，并用 PBS 液冲洗收集培养皿中剩余肺组织；

倒置显微镜,小鼠,细胞形态,生长特点

密度低处呈单层生长，密度高处呈重叠生长，表现出典型的血管平滑肌细胞“峰—谷”状生长特点（图2D）。A：第 1 天；B：第 7 天；C：第 10 天；D：第 13~15 天图 2 原代培养的小鼠 PASMCs，不同培养时间的细胞形态（倒置显微镜下, 40×）2.2 PASMCs 的纯化及存活率小鼠远端 PASMCs 原代培养时，最初从含铁的肺小动脉组织周围爬出的细胞为

【相似文献】