长链非编码RNA-Morrbid与急性心梗相关性研究

发布时间：2020-06-20 17:58

【摘要】：研究背景与目的:随着社会经济的发展,心血管事件发生呈逐年递增的趋势。其中,高致死、高致残的急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)已成为导致人类死亡的首要病因。急性心肌梗死(AMI)是指冠状动脉急性、持续性缺血血氧所引起的心肌坏死,为了对抗这个心肌梗死,人类已经从不同方向上进行探索。例如鉴于心肌细胞无法生长的特性,干细胞方向的研究就是寻求形成新的心肌细胞来补充心梗后梗死区域死亡的心肌细胞,以期进一步恢复心功能,改善患者预后。另一个方向就是针对心梗后边缘区域的濒死状态的心肌细胞的拯救,通过研究某些特殊非编码RNA或蛋白质的功能来拯救濒死状态心肌细胞,减小梗死区域范围是其中较为新颖的研究方向。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lnc RNA)是一组转录物长度大200个nt(核苷酸),缺少特异完整开放阅读框并且无蛋白质编码功能的RNA。研究发现,长链非编码RNA通过调控组蛋白修饰、染色质重构、转绿水平以及转绿后水平等方式,在细胞周期、增殖、迁移和代谢等方面发挥重要作用,近年关于lnc RNA的研究已然成为各个领域的研究热点。近年来,多项研究成果都表明lnc RNA对急性心梗等多种心血管疾病具有调控作用。Morrbid(myeloid RNA regulator of Bim-induced death)是2016年发现的一个新的与细胞死亡相关的lnc RNA而且人鼠同源,但在心血管领域并没有任何与Morrbid相关的研究成果发表。通过前期对乳鼠原代心肌细胞以及HCM细胞内Morrbid表达量等的探索性研究,认为Morrbid可能对心肌细胞的死亡也具有一定的调节作用。实验目的:(1)通过q PCR技术探究Morrbid在C57小鼠急性心梗模型中的表达。(2)通过q PCR技术探究Morrbid在人与小鼠心肌细胞缺氧模型中的表达趋势。(3)在细胞层面调控Morrbid表达,观察其对细胞凋亡的影响。(4)在野生型C57小鼠体内调控Morrbid表达,观察其对急性心梗后心功能的影响。(5)在敲除Morrbid基因的小鼠上观察Morrbid-KO后其对急性心梗后心功能的影响。(6)通过数据库筛选,寻找Morrbid可能的上下游基因。(7)在乳鼠原代心肌细胞缺氧模型与C57小鼠急性心梗模型中通过q PCR与Western blot技术验证下游基因的可靠性。(8)在调控后的人与小鼠细胞样本上通过q PCR与Western blot技术验证下游基因的可靠性。(9)在调控后的C57小鼠心脏与敲除Morrbid基因的小鼠心脏上验证下游基因的可靠性。(10)用乳鼠原代心肌细胞凋亡实验,验证上下游基因的可靠性。材料与方法:实验用购买自美国模式培养物集存库,(American Type Culture Collection,ATCC)的人类心肌细胞(Human Cardiac Myocyte,HCM),购买自Jackson Lab的C57小鼠和C57乳鼠原代心肌细胞(Neonatal Mouse Cardiomyocyte,NMC),以及购买自北京百奥赛图公司的Morrbid-KO基因小鼠作为研究对象,采用q PCR技术检测样本中基因表达量的变化;通过Tunel染色观察缺氧处理后各组细胞凋亡的形态学变化。通过B超测量各组小鼠急性心梗模型后心功能的变化,采用TTC与Evans blue双染色的方法拍照心脏切片心梗区去危险区的比值。同时,对同一心脏组织进行固定,做冰冻切片后,通过Tunel染色观察各组心肌组织细胞凋亡的形态学变化。应用Western blot技术验证下游基因在缺氧模型、心梗模型以及调控后样本中的含量变化。结果:1.在小鼠急性心梗模型中,心梗组比Sham组Morrbid表达量明显增高;在NMC细胞缺氧模型中Morrbid表达量在缺氧的各个时间点都比未做缺氧处理的对照组(0h)有所升高;在HCM细胞的缺氧模型中,Morrbid的整体趋势依然是上升的,缺氧48小时组Morrbid表达量比0h的对照组Morrbid表达量明显增高。2.在NCM细胞凋亡实验中,Morrbid上调组细胞凋亡率明显低于对照组,Morrbid下调组细胞凋亡率明显高于对照组,即Morrbid在NCM细胞凋亡模型中起抗凋亡作用。3.在小鼠急性心梗模型中,Morrbid上调组的心功能明显优于对照组,且Morrbid基因敲除组的心功能也明显比对照组差;Morrbid上调组的I/A明显小于对照组,Morrbid基因敲除组的I/A也明显大于对照组;Morrbid上调组的心肌组织凋亡率明显低于对照组,Morrbid基因敲除组的心肌组织凋亡率也明显高于对照组。4.Morrbid下游基因Serpine1在小鼠急性心模型、NMC细胞H202损伤模型中,其表达量均与Morrbid表达量相一致。5.在小鼠体内心肌注射腺病毒上调Morrbid后,下游基因Serpine1的表达也上调,敲除Morrbid基因后,下游基因Serpine1的表达下降;同时在HCM细胞中用腺病毒调控Morrbid后,下游基因Serpine1的表达均出现相应的变化,与小鼠体内实验相一致。6.在NCM细胞凋亡实验中,上调Morrbid后,用Si RNA下调Serpine1,可以部分的阻断Morrbid抗凋亡作用。7.在NCM细胞中,加入PI3K抑制剂LY294002处理,可以抑制Morrbid表达增高。结论:1.长链非编码基因Morrbid在NMC细胞中起抗凋亡作用。2.长链非编码基因Morrbid在小鼠急性心梗中对心功能具有保护作用。3.长链非编码基因Morrbid的抗凋亡作用有部分是通过调控其下游基因Serpine1实现。
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R542.22
【图文】：

第三,图像

图4-B：第一行是加 GFP,但不缺氧组；第二行是加 GFP,缺氧组；第三行是是加 MB OVE缺氧组；（100 倍镜图像）0102030CON&MB SI RNAApoptosiscels(%)***Hypoxia-24hVehicleMorrbid-siRNA+++_+_

图像,小鼠,腺病毒,急性心梗

图 4-D：第一行是 control 缺氧组；第二行是加 Morrbid siRNA 缺氧组；（100 倍镜图像5. 动物实验结果5.1 心脏注射腺病毒调控 Morrbid，小鼠急性心梗模型后各项结果对 12 周龄的 C57 小鼠进行随机分组，一组注射 GFP 腺病毒，一组注射Morrbid over expression 腺病毒[76]，48 小时之后，结扎小鼠左前降支，构建性心梗模型。建模 24 小时后，B 超检测两组小鼠心功能，取出心脏做 TTC 与伊文氏蓝双染色以及心肌组织 Tunel 染色。5.1.1 心脏注射腺病毒调控 Morrbid，小鼠急性心梗模型后 B 超结果急性心梗建模 24 小时后，B 超检测两组小鼠各项指标，其中左室射血分数，Morrbid over expression 组的 EF%值（37.91 ±1.872, n=20）明显高于 GF组的 EF%值（26.3 ±1.385, n=24）且（P＜0.0001）；左室短轴缩短率，Morrover expression 组的 FS%值（18.05 ±0.9934, n=20）明显高于 GFP 组的 FS%值（12.09 ±0.68, n=24）且（P＜0.0001）；左室舒张期内径，Morrbid over express组的 LVEDD 值（3.737 ±0.08455, n=20）明显低于 GFP 组的 LVEDD（4.153

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