肺炎衣原体经TLR2通过CXCR4-β-arrestin 2通路入侵血管平滑肌细胞

发布时间：2020-06-22 19:17

【摘要】：目的:利用肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae,C.pneumoniae)体外感染血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)模型,观察C.pneumoniae在入侵VSMC过程中Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)和C-X-C趋化因子受体4(C-X-C chemokine receptor type 4,CXCR4)的相互作用,证实C.pneumoniae经TLR2通过CXCR4-β-arrestin 2通路入侵VSMC。方法:1.C.pneumoniae增殖培养后体外感染VSMC;2.采用Western blot技术检测C.pneumoniae感染VSMC后TLR2、CXCR4和CXCR7蛋白表达水平;3.Western blot技术分别检测C.pneumoniae感染VSMC后TLR2、CXCR4和CXCR7细胞膜和胞浆部分的蛋白表达水平;4.激光扫描共聚焦显微镜观察C.pneumoniae感染VSMC后TLR2、CXCR4和CXCR7蛋白分布情况;5.应用RNA干扰技术分别使TLR2、CXCR4、CXCR7和β-arrestin 2表达水平下调,Western blot检测这些蛋白表达水平以确定干扰效能;6.应用RNA干扰技术使TLR2、CXCR4、CXCR7和β-arrestin 2表达水平下调,免疫荧光染色法观察VSMC的C.pneumoniae感染率;7.激光扫描共聚焦显微镜观察C.pneumoniae感染VSMC后TLR2和CXCR4、TLR2和CXCR7的共定位;8.免疫共沉淀实验检测C.pneumoniae感染VSMC后TLR2和CXCR4、TLR2和CXCR7的互相作用;9.邻位连接(proximity ligation assay,PLA)技术观察C.pneumoniae感染VSMC后TLR2和CXCR4、TLR2和CXCR7的互相作用;10.PLA技术观察C.pneumoniae感染VSMC后CXCR4对β-arrestin2的募集作用;11.应用RNA干扰技术使TLR2表达水平降低,Western blot检测C.pneumoniae感染引起的CXCR4蛋白分布的变化;12.应用RNA干扰技术使TLR2表达水平降低,PLA技术观察C.pneumoniae感染对CXCR4募集β-arrestin 2作用的影响。结果:1.C.pneumoniae感染VSMC后15min TLR2蛋白表达水平开始升高,持续至C.pneumoniae感染VSMC后30 min、60 min、120 min和180 min,与正常对照组相比,差异有统计学意义(P0.05);2.C.pneumoniae感染VSMC后60 min,细胞膜上TLR2的表达水平升高,与正常对照组相比,差异有统计学意义(P0.05),而在感染后180 min,细胞膜上TLR2的表达恢复至正常水平。胞浆中TLR2的表达水平在C.pneumoniae感染VSMC后60 min降低,与正常对照组相比,差异有统计学意义(P0.05),感染后180 min胞浆中TLR2的表达水平又恢复至正常水平;激光共聚焦显微镜观察TLR2蛋白的分布情况和上述结果一致;3.与C.pneumoniae+scr RNA组相比,C.pneumoniae+TLR2 si RNA组感染率降低,差异有统计学意义(P0.05);4.C.pneumoniae感染VSMC后CXCR4蛋白表达水平与感染前相比无显著变化;C.pneumoniae感染VSMC后15 min,细胞膜上CXCR4的表达水平开始升高,感染后60 min细胞膜上CXCR4的表达水平达到最高,感染后180 min细胞膜上CXCR4的表达水平有所降低但仍高于正常水平,与正常对照组相比,差异有统计学意义(P0.05)。而胞浆中CXCR4的表达水平在C.pneumoniae感染VSMC后15 min降低,一直持续至感染后180 min,与正常对照组相比,差异有统计学意义(P0.05);激光共聚焦显微镜观察CXCR4蛋白分布情况和上述结果一致;5.与C.pneumoniae+scr RNA组相比,C.pneumoniae+CXCR4 si RNA组感染率降低,差异有统计学意义(P0.05);6.C.pneumoniae感染VSMC后15 min CXCR7蛋白表达水平开始升高,感染后30 min、60 min、120 min和180 min均明显高于感染前,差异有统计学意义(P0.05);C.pneumoniae感染VSMC后15 min,细胞膜上CXCR7的蛋白表达水平开始升高,感染后60 min细胞膜上CXCR7的蛋白表达水平降低至正常水平之下,感染后180 min细胞膜上CXCR7的表达水平又再次升高,与正常对照组相比,差异有统计学意义(P0.05)。而胞浆中CXCR7的蛋白水平在C.pneumoniae感染VSMC后15 min升高,持续至感染后180 min,与正常对照组相比,差异有统计学意义(P0.05);激光共聚焦显微镜观察CXCR7蛋白分布情况和上述结果一致;7.与C.pneumoniae+scr RNA组相比,C.pneumoniae+CXCR7 si RNA组感染率降低,差异有统计学意义(P0.05);8.激光扫描共聚焦显微镜、免疫共沉淀技术和PLA技术结果显示C.pneumoniae感染VSMC后TLR2和CXCR4的相互作用明显增强,而TLR2和CXCR7的相互作用无显著变化;9.PLA技术结果显示C.pneumoniae感染VSMC后CXCR4对β-arrestin 2的募集作用增强;10.与C.pneumoniae+scr RNA组相比,C.pneumoniae+β-arrestin 2 si RNA组感染率降低,差异有统计学意义(P0.05);11.沉默TLR2的表达后,C.pneumoniae+TLR2 si RNA组细胞膜上和胞浆中CXCR4的蛋白表达水平无显著变化;由C.pneumoniae诱导的CXCR4对β-arrestin 2的募集作用明显减弱。结论:C.pneumoniae通过增强TLR2和CXCR4的相互作用入侵VSMC;C.pneumoniae可能经TLR2通过CXCR4-β-arrestin 2通路入侵VSMC。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R54
【图文】：

感染后,统计学意义,时间点,博士学位论文

天津医科大学博士学位论文一、C. pneumoniae 经 TLR2 入侵 VSMC用 Least-significant Differece（LSD）检验。P ＜ 0.05 有统计学意义。1.2 结果1.2.1 C. pneumoniae 感染使 VSMC TLR2 蛋白表达增多Western blot 结果显示，75 kD~100 kD 之间靠近 100 kD 处有蛋白条带，与TLR2 的分子量 95 kD 基本相符。如图 1 所示，TLR2 的蛋白表达水平在 Cpneumoniae 感染 VSMC 后 15 min 即开始升高，感染后 30 min、60 min、120 mi和 180 min 均明显高于正常对照组，使用 Image_J 软件进行数据统计分析，感染后各时间点 TLR2 的表达水平与正常对照组相比差异有统计学意义（P ＜ 0.05（图 2）。而感染后各时间点之间的 TLR2 蛋白表达水平差异无统计学意义。

感染后,数据统计分析,统计学意义,统计学

C. pneumoniae 感染使 VSMC TLR2 蛋白表达增多estern blot 结果显示，75 kD~100 kD 之间靠近 100 kD 处有蛋白条的分子量 95 kD 基本相符。如图 1 所示，TLR2 的蛋白表达水平oniae 感染 VSMC 后 15 min 即开始升高，感染后 30 min、60 min、 min 均明显高于正常对照组，使用 Image_J 软件进行数据统计分析间点 TLR2 的表达水平与正常对照组相比差异有统计学意义（P ＜）。而感染后各时间点之间的 TLR2 蛋白表达水平差异无统计学意图 1 C. pneumoniae 感染对 VSMC TLR2 蛋白表达水平的影响

【参考文献】