【摘要】：心力衰竭(Heart failure,HF)是由各种疾病引发的心肌收缩功能减弱,使心脏泵出的血液量减少,无法搏出静脉回流和身体组织代谢需要的血液供应,以及由此产生的一系列症状和体征,是各种心血管疾病的共同结局。压力负荷过重是导致心力衰竭的重要原因。在正常的情况下,心脏的大部分能量来源于脂肪酸氧化,但是在心衰发生时,心肌细胞的能量代谢过程发生明显的变化,脂肪酸的代谢也出现明显异常。同时,心脏脂肪酸β氧化的改变能够导致心肌能量代谢异常,与心力衰竭的发生密切相关。目前,细胞内脂滴(Lipid droplets,LD)目前被认为是一个参与能量代谢的“细胞器”,能够储存脂质并在脂质代谢过程中起着非常重要的作用,与很多代谢性疾病的发生发展有关。脂滴中的脂滴表面蛋白是一类参与脂滴代谢调节的分子,其中,PAT家族最为重要,Plin5是现阶段发现的第5个PAT家族的成员,主要表达于氧化代谢比较活跃的组织中,例如心脏、肝脏、骨骼肌和褐色脂肪组织(Brown Adipose Tissue,BAT)等,又被称为MLDP(Myocardial lipid droplet protein)、LSDP5(Lipid storage droplet protein5)、Perilipin 5,或OXPAT。Plin5在心脏组织中表达水平最高,Plin5缺失能够加快脂解作用以及脂肪酸氧化速度,从而造成心脏和肝脏的脂毒性损伤。本实验在Plin5敲除小鼠模型的基础上,通过升主动脉缩窄术(Transverse aortic constriction,TAC),建立心衰的动物模型,来研究Plin5在压力负荷性心衰发生过程中的作用及可能的分子机制,为心衰的治疗提供参考。1、Plin5缺失加重TAC诱导的小鼠心肌肥大以及心脏功能的下降。8周龄的野生型和Plin5敲除小鼠分别进行升主动脉缩窄术(TAC)。术后四周取各组小鼠心脏,计算小鼠心脏重量(Heart weight,HW)/小鼠整体重量(Body weight,BW)。同时,对小鼠心脏进行HE染色,采用Cell Sens Entry软件随机选择5个不同视野,计算心肌细胞横截面积。结果显示,TAC术后,Plin5敲除小鼠HW/BW相比野生组明显升高,而且Plin5敲除小鼠心肌细胞横截面积相比野生组明显增大。这些结果提示,Plin5缺失加剧TAC诱导的小鼠心肌肥厚。TAC术后四周,应用超声仪及高频探头行经胸二维心脏超声检查(M模式)获得野生型和Plin5敲除小鼠的心动图,分别测定左室收缩末期内径(Left ventricular systolic internal dimension,LVID;S),左室射血分数(Ejection fraction,EF),左心室短轴缩短率(Fraction shortening,FS)。结果显示,Plin5缺失加剧TAC诱导的左心室收缩末期心室腔扩张程度,并导致心脏功能明显下降。2、Plin5缺失降低心脏中脂滴储存降低,并增加了非酯化脂肪酸的水平。TAC术后四周,取各组心脏组织,行油红O染色,结果显示Plin5缺失小鼠心肌中脂滴含量明显降低;心肌组织的甘油三酯(Triglyceride,TG)定量分析显示,Plin5敲除小鼠导致心肌组织中TG含量明显下降,而游离脂肪酸(FFA)的水平却高于野生型小鼠,但野生型小鼠和Plin5敲除小鼠血清中FFA未出现明显变化。TAC术后,小鼠心肌组织内脂滴数量和TG含量,以及心肌组织和血中游离脂肪酸(FFA)水平也出现类似的变化。这些结果表明,Plin5缺失能够降低心肌组织内脂肪的储积,而增加游离脂肪酸水平。3、Plin5缺失导致小鼠心肌组织中线粒体数量增多,并且加剧TAC术后的心肌过氧化损伤。取TAC术后四周小鼠心室组织,利用透射电镜观察心肌组织超微结构,结果发现,Plin5缺失增加小鼠心肌细胞中的线粒体数量,而且TAC术后Plin5缺失小鼠心肌细胞中线粒体数量也明显多于野生型小鼠,尽管TAC术造成心肌细胞线粒体数量的减少。Western Blot结果显示,线粒体中重要分子Cox IV以及Cytochrome C水平升高,且Real-time PCR也显示Cox IV以及Cytochrome C m RNA水平升高,表明线粒体数量增加,与电镜观察的结果一直。TAC术后,Plin5敲除小鼠的心肌组织中Cox IV和Cytochrome C的蛋白和m RNA水平均出现降低,与野生型小鼠类似。以上结果说明,Plin5缺失能够增加心肌组织中线粒体的数量。TAC术后4周,取各组小鼠心脏组织,检测各组小鼠心肌组织中的MDA,SOD以及ROS水平。研究结果发现,在假手术组中,Plin5缺失小鼠心脏组织中MDA含量略高于野生小鼠,而TAC术后Plin5缺失心肌组织中MDA水平明显升高;在假手术组,Plin5缺失小鼠心肌内SOD的活性没有明显差异,而在TAC术后Plin5缺失小鼠心脏组织中SOD活性明显降低;在假手术组中,尽管Plin5缺失小鼠心肌组织ROS含量相对于野生型小鼠没有明显变化,但在TAC术后,Plin5缺失小鼠心脏组织中ROS含量明显高于野生小鼠。结果表明,Plin5缺失加剧了TAC导致的心脏过氧化损伤。4、Plin5缺失加剧了TAC引起的小鼠心肌中PGC-1α与PPARα表达水平升高的程度。TAC术后4周,取各组心室组织,Western Blot测定各组小鼠心肌中PGC-1α与PPARα的表达水平,结果显示,TAC术后,Plin5敲除和野生型小鼠心肌中PGC-1α与PPARα的表达水平相比假手术组均有明显升高,而Plin5敲除小鼠的升高更加显著。同时,Real-time PCR检测Plin5敲除和野生型小鼠心肌中PGC-1α与PPARα表达水平,发现结果与Western Blot基本一致。这些结果显示,TAC术后,小鼠心肌中PGC-1α与PPARα的表达水平升高,同时,Plin5缺失加剧了TAC引起的小鼠心肌中PGC-1α与PPARα表达水平升高的程度。本研究利用升主动脉缩窄术(TAC)研究了Plin5敲除小鼠压力负荷性心衰的发生过程,以明确Plin5在压力负荷性心衰发生过程中的作用。研究结果显示,Plin5缺失加剧TAC诱发的小鼠心肌肥厚程度以及左心室收缩末期心室腔的扩张,导致心脏功能下降。进一步的研究发现,Plin5缺失降低了心脏中脂滴的储存,并激活PPARα活性,增加线粒体数量,使脂肪酸的氧化速率加快。脂肪酸氧化速度的增加导致心肌细胞内产生过量的ROS,从而导致心肌的脂毒性(Lipotoxicity)损伤,加快了TAC导致的小鼠心衰程度。这些结果提示,Plin5缺失小鼠心肌中脂滴含量明显减少,刺激PGC-1α以及PPARα表达水平升高,从而调节脂肪酸氧化中的关键分子,使线粒体增值,脂肪酸氧化速度加快,产生大量的ROS,进而引发心肌细胞的氧化损伤,加重TAC导致的心脏损伤。这些结果对明确Plin5在心肌中的功能,以及脂肪代谢异常在心衰发生过成汇总的作用具有重要的意义。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R541.6
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本文编号：
2727917
