自噬在κ-阿片受体兴奋抗低氧性肺高压中的作用及机制

发布时间：2020-07-09 09:40

【摘要】：背景:肺高压(pulmonary hypertension,PH)是一种临床常见的病理过程,也是临床多种心肺疾病常见的并发症,低氧性肺高压(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)是其中一种重要的类型。HPH的基本特征是肺动脉血管的收缩和重构,导致右心衰竭和死亡~([1-3]),但是其发病机制尚不清楚。以往研究证明肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cell,PASMC)的增殖是肺血管重构发生的关键因素~([4-6])。因此,抑制低氧时PASMC的增殖和血管的重构是防治HPH的重要措施之一。κ-阿片受体(κ-opioid receptor,κ-OR)在心血管系统中广泛存在~([7])。我们课题组前期发现,κ-OR选择性激动剂U50,488H能够通过兴奋κ-OR发挥抗心肌缺血再灌注损伤的作用。此外还发现,κ-OR在肺动脉上也有表达并且在低氧时其表达明显增高~([8])。进一步实验表明U50,488H可兴奋κ-OR发挥抗HPH的作用,但是其具体作用机制尚不清楚。自噬是一种细胞适应性的降解过程,在生理与病理状态下都发挥着重要的作用。自噬一方面可以清除细胞内的毒性物质、病原体以及受损的细胞器等,从而维持细胞的正常代谢平衡和内环境的稳态;另一方面外界刺激可能会引发过度的自噬,破坏了细胞环境的稳态,进而引发某些疾病。近年来的研究发现PH病人和HPH小鼠的肺组织中自噬的标志性蛋白LC3B的表达均升高,说明可能自噬与HPH的发生关系紧密,随后有研究证实使用自噬抑制剂氯喹可能具有抗HPH的作用。那么κ-OR兴奋后抗HPH的作用机制是否与自噬有关呢?我们进一步检索文献表明,μ-OR的兴奋能够抑制脂多糖诱导的骨髓巨噬细胞的自噬~([9]),但是κ-OR的兴奋是否对PASMC的自噬有调节作用仍不清楚。为此,我们利用HPH的整体和细胞模型,观察了PASMC自噬在κ-OR兴奋抗HPH中的作用及机制。目的:(1)探究κ-OR兴奋在抗HPH中的作用;(2)探究自噬在HPH中的作用;(3)探究自噬在κ-OR兴奋抗HPH中的作用及机制。方法:(1)将雄性SD大鼠置于低压低氧箱(大气压50 kPa,氧浓度约10%)中,每天低氧的时间为8 h,连续3周。低氧处理结束后,进行血流动力学检测,研究κ-OR选择性激动剂U50,488H、κ-OR选择性阻断剂nor-BNI以及自噬抑制剂氯喹对HPH大鼠的平均肺动脉压力(mean pulmonary arterial pressure,mPAP)和右心室压力(right ventricle pressure,RVP)的影响。(2)用HE染色检测U50,488H、nor-BNI以及氯喹对于HPH大鼠肺血管重构的影响。(3)对PASMC进行原代和传代培养,置于低氧培养箱(93%N_2,5%CO_2,2%O_2,37℃)中24 h建立HPH细胞模型。(4)用CCK8试剂盒检测U50,488H、nor-BNI以及氯喹对低氧时PASMC增殖的影响。(5)用流式细胞术检测U50,488H、nor-BNI和氯喹对低氧时PASMC凋亡的影响。(6)用Western blotting检测组织和细胞中的β-actin、LC3B、p62、Beclin-1、caspase3、p-mTOR、mTOR、p-AMPK、AMPK蛋白分子表达。(7)用mRFP-GFP-LC3荧光双标腺病毒转染PASMC检测细胞自噬过程的变化。结果:一、κ-OR兴奋在抗HPH中的作用(1)慢性低氧3周后,大鼠的mPAP和RVP都有显著的提高,肺血管的厚度增加,管腔减小;在细胞水平,低氧24 h可诱导PASMC显著增殖,表明成功建立了动物以及细胞的HPH模型。(2)k-OR选择性激动剂U50,488H能够通过兴奋k-OR逆转慢性低氧引起的mPAP和RVP的增加,抑制低氧引起的肺小动脉的结构重构,k-OR选择性阻断剂nor-BNI能够阻断以上U50,488H的作用。(3)在细胞水平,U50,488H可以剂量依赖性地抑制低氧诱导的PASMC的增殖并促进其凋亡,这种作用可以被nor-BNI所阻断。二、自噬在HPH中的作用(1)低氧能够诱导HPH的形成,低氧前给予自噬抑制剂氯喹能够降低HPH大鼠的mPAP和RVP,抑制HPH大鼠肺血管的重构。(2)在细胞水平,低氧前给予自噬抑制剂氯喹,不仅可以抑制低氧诱导的PASMC的增殖,还能够促进它的凋亡。三、自噬在κ-OR兴奋抗HPH中的作用及机制(1)低氧3周后,检测肺动脉自噬分子LC3B、Beclin-1和p62的表达,发现与正常组即常氧组相比,HPH大鼠肺动脉的LC3B-II/-I的比值与Beclin-1的表达明显增高而p62的表达降低,说明低氧诱导自噬水平增高。(2)与低氧组相比,低氧前预先给予U50,488H可显著降低肺动脉LC3B-II/-I的比值和Beclin-1的表达,同时增加p62的表达,表明U50,488H能够抑制HPH大鼠的自噬。(3)在细胞水平,低氧时PASMC自噬水平升高。Western blotting以及mRFP-GFP-LC3荧光结果提示,低氧前预先给予U50,488H能够浓度依赖性的抑制低氧时PASMC的自噬,这种作用可以被nor-BNI所阻断。(4)低氧时U50,488H可以通过抑制自噬来达到抗PASMC增殖和诱导PASMC凋亡的作用。(5)低氧可提高PASMC的AMPK的磷酸化和mTOR的去磷酸化,而U50,488H则能够逆转低氧诱导的这种变化,U50,488H这种作用可被nor-BNI所阻断。(6)AMPK选择性激动剂AICAR和mTOR选择性阻断剂rapamycin都能够减弱低氧时U50,488H对PASMC自噬的抑制作用。结论:(1)κ-OR兴奋具有抗HPH的作用。(2)低氧可促进PASMC自噬,而后者可导致PASMC的增殖和降低PASMC的凋亡,最终导致HPH的发生。(3)κ-OR兴奋能够通过抑制AMPK-mTOR信号通路进而抑制自噬,降低了低氧时PASMC的增殖并且促进了PASMC的凋亡,最终达到抑制肺血管的重构和抗HPH的作用。
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R544.1
【图文】：

示意图,低氧刺激,示意图

图 1 低氧刺激下肺血管变化示意图我国高原面积广，海拔高，人口多，高原地区占我国国土面积的 26%，居住在2500m 海拔以上的人口有 6000~8000 万，因而积极探究 HPH 的发病机制以及寻找有效的治疗疾病的方法显得尤为重要。2.2 HPH 的发病机制当机体受到低氧的刺激后，就会通过促进红细胞生成来提高动脉血氧的浓度。研究表明，除少部分种属会出现抵抗外，在鼠和人类等多种种属中都观察到慢性低氧刺激会引起肺血管重构。然而，红细胞的生成量会因为低氧刺激导致的肺血管收缩和重构进一步增多，引起右心室负荷增加，最终导致右心衰竭而死亡。HPH的主要病理基础是远端正常的非肌性动脉的肌化所导致的血管壁增厚以及肌性动脉肌化的增多。缺氧的直接作用点是内皮细胞，低氧环境的刺激会导致内皮细胞损伤，细胞肥大、增生并且功能出现异常，造成血小板活化和凝集、血栓调节素及纤维蛋白溶解系统异常，肺血管通透性增加[25]，肺动脉原位血栓形成；与此同

示意图,自噬,自噬体,分隔膜

- 22 -图 2 自噬的三种途径示意图自噬的发生过程大致分 4 个阶段（如图 3）：（1）自噬体膜新生与延伸：在饥饿及某些因素的影响下，降解物被双层膜的杯状分隔膜所包绕；（2）自噬体结构成熟化：分隔膜不断延伸，包绕被降解的胞浆成为自噬体；（3）自噬-溶酶体融合：自噬

示意图,自噬,过程,示意图

- 23 -图 3 自噬过程示意图2.自噬的功能自噬过程在细胞正常生理和病理状态下都有存在，但是发挥的作用却不完全一致。正常状态下细胞很少发生自噬，有刺激因素时细胞出现自噬，自噬可以清除细胞内的毒物、病原体以及受损的细胞器来保持细胞重要的功能，维持细胞的生存；同时也可能会出现过度的自噬，破坏了细胞环境的稳态，进而引发某些疾病。2.1 自噬的生理功能（1）自噬与细胞代谢：自噬能够通过清除缺陷蛋白以及降解受损和多余的细胞器参与细胞新陈代谢和维持细胞内环境的稳态。

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