葛根素对人源肥大心肌细胞动作电位的影响及机制研究

发布时间：2020-07-09 12:02

【摘要】：多种心血管疾病可导致心肌肥大,处于失代偿阶段的肥大心肌细胞,除了收缩舒张功能下降之外,也会出现电生理活动的紊乱,由此诱发心律失常的发作。开发既能够抗心肌肥大,又能够抗心律失常的药物,显得尤为重要。葛根素(Puerarin)具有多种药理活性,既往研究证实葛根素可以抑制心肌肥大,但对于葛根素的抗心律失常作用,特别是针对人源肥大心肌细胞的抗心律失常作用,则未见报道。目的:探讨葛根素对人源肥大心肌细胞电生理活动的影响。方法:从健康人体排出的尿液中提取上皮样细胞,然后将携带Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc基因的仙台病毒转染上皮样细胞,经重编程得到人源诱导多能干细胞(Human Induced pluripotent stem cells,hIPSCs),并检测其多能性。将诱导多能干细胞单层培养,并在细胞生长不同阶段加入WNT信号通路激活及抑制剂的时序性调控方法,将人源诱导多能干细胞定向分化为心肌细胞。然后模拟心肌肥大患者体内局部ET-1浓度的明显升高,通过培养基中加入ET-1来诱导心肌细胞肥大,制作肥大心肌细胞模型。利用实时无标记细胞分析仪进行葛根素对心肌细胞的安全性检测。最后运用全细胞膜片钳技术,测定葛根素对肥大心肌细胞电生理活动的影响。结果:成功地从人体排出的尿液中提取上皮样细胞,对获得的hIPSCs进行碱性磷酸酶及多能标志物的免疫荧光染色,同时也进行了畸胎瘤形成试验,证实获得的hIPSCs具有多能性,并对获得的hIPSCs进行了染色体核型分析,结果显示其染色体核型正常。hIPSCs定向分化为心肌细胞,可表达肌钙蛋白(TNNT2)和a-肌动蛋白(a-actinin)以及心肌特异基因NKX2-5、MYL2、MYH6和MYH7。用ET-1诱导人源心肌细胞,观察到心肌细胞出现肥大反应,检测到BNP、α-actinin明显升高,MYH7/MYH6比值增大。实时无标记细胞分析仪结果提示,系列浓度葛根素对心肌细胞的cell index、beating rate、amplitude影响不大。肥大心肌细胞组以及葛根素后处理组轻微延长hiPSC-CMs APD90,明显延长了APD50和APD30,延长了心肌细胞动作电位整体时程。心肌细胞动作电位0期除极幅度(APA)没有显著性差异,对0期最大除极速度(Vmax)有明显减小的作用。与对照组相比,肥大心肌细胞组钠通道峰值电流密度显著降低。葛根素组及葛根素后处理组不能改善肥大心肌细胞钠通道的电流。但是,葛根素预处理可以改善肥大心肌细胞钠电流。各组激活曲线、失活曲线V50及Slope和恢复曲线Tau之间的比较无明显统计学差异。结论:获得的诱导多能干细胞可定向分化为心肌细胞,其电生理学高度近似于成人心室肌细胞;葛根素对肥大心肌细胞动作电位的0期最大除极速度有改善作用,其机制可能是通过增加INa峰值密度。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R54
【图文】：

逦博士学位论文贴壁现象，见图１－１Ｂ。继续培养，可观察到上皮样细胞开始增殖，见图１－１Ｃ。逡逑继续培养至第７天及第１０天，可观察到上皮样细胞增殖更为明显，见图１－１及图１－１Ｅ。培养至第１０天观察细胞团足以传代，使用０．２５％胰酶消化进行传代细胞传代后继续培养，直至Ｐ２代（图１－１Ｆ），可开始启动重编程，并冻存部保种。逡逑

２．２上皮样细胞重编程逡逑转染当天，可观察到上皮样细胞生长状态良好，细胞完全贴壁和伸展，见逡逑图１－２Ａ。转染后１２天可以观察到克隆的形成，见图１－２Ｂ；转染后２８天，克隆逡逑生长到合适的大小用于转移，见图１－２Ｃ；挑取克隆，将其转移至培养皿上用于逡逑进一步的扩增和分析，见图１－２Ｄ。逡逑图１－２上皮样细胞重编程图片逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ－２邋Ｉｍａｇｅｓ邋ｏｆ邋ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ邋ｏｆ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉｏｉｄ邋ｃｅｌｌｓ逡逑２．３邋ＩＰＳＣｓ免疫荧光染色逡逑用免疫荧光染色法检测上皮样细胞重编程所获得的ＩＰＳＣｓ的多能标记物，逡逑包括邋ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＳＳＥＡ－４邋的表达情况，可检逡逑测到这些多能标记物在活动的ＩＰＳＣｓ细胞中均可表达，见图１－３。逡逑１８逡逑

第一部分获得人源诱导多能干细胞ｉｇｕｒｅ邋１－３邋Ｉｍａｇｅｓ邋ｏｆ邋ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ邋ｍａｒｋｅｒｓ邋ｉｎ邋ＩＰＳＣｓ邋（Ａ＞邋Ｄ＞逡逑、Ｍ、Ｐ邋ａｒｅ邋ＤＡＰＩ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ；邋Ｂ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ邋ａｒｅ邋ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ＴＲＡ－１－ＴＲＡ－１－８１、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＳＳＥＡ－４；Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｏ、Ｒａｒｅ邋ｍｅｒｇｅｒ）逡逑．４逦ＩＰＳＣｓ核型分析结果逡逑ＩＰＳＣｓ进行核型分析，结果显示，染色体４６条，核型正常，见图１

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