STEAP4在二甲双胍改善心肌缺血再灌注损伤中的作用及其机制研究

发布时间：2020-07-12 14:05

【摘要】：目的:急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)已经成为了当今世界上最严重且死亡率最高的疾病之一,随着当前人们生活方式的变化,导致AMI发病率仍每年呈上升趋势。目前最有效的治疗方法就是通过经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous transluminal coronary intervention,PCI)尽可能快的恢复心肌血液再灌注。但是再灌注本身也带来了许多副作用,缺血能引起心肌超微结构,能量代谢功能和电生理一系列损伤,该损伤在血管再通后表现得更为突出,甚至导致严重的心律失常最终造成心源性猝死。这种情况被称为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)。MIRI的发生比较复杂,多种机制涉及其中,比如细胞内氧自由基的大量产生,钙离子超负荷,白细胞的炎症作用以及高能磷酸化合物缺乏,细胞凋亡等。在再灌注后心肌中,心肌细胞存活的数量直接影响到后续的心脏功能和生活质量,而MIRI后引起的细胞凋亡严重减少活性的心肌细胞,可以导致再灌注后心功能进一步恶化。所以关注如何减少MIRI引起的细胞凋亡也成为了重要的研究课题。研究发现心肌缺血预处理和后处理能够有效的改善MIRI,但是在临床操作中涉及到伦理道德问题,故可行性不佳,而探索有效的药物干预手段来阻止心肌细胞凋亡成为预防MIRI的一个重要突破口。二甲双胍(metformin)作为一种双胍衍生物,是一种传统的降血糖药。但是近年来该药越来越多的药物多效性被挖掘出来,包括抗炎,抗氧化,保护内皮功能,减少血栓形成,抗心肌凋亡等。其在糖尿病伴有MIRI中抗心肌细胞凋亡作用已经有报道,比如通过激活AMPK通路减少心肌细胞凋亡。但是二甲双胍对对MIRI保护多表现在患有糖尿病或代谢综合征患者中,而针对单纯MIRI的保护作用临床上仍有争议,其中的机制探讨也未完全明确,故二甲双胍作为一种廉价、安全及广泛运用的降血糖药物值得进一步探讨其抗心肌细胞凋亡的机制。前列腺六次跨膜上皮抗原4(six-transmembrane epithelial antigen of prostate 4,STEAP4),最初发现其可诱导脂肪细胞分化,并促进脂肪细胞吸收葡萄糖,影响细胞能量代谢以及抗凋亡。二甲双胍被证实增加人CD34~+细胞在缺氧条件下的STEAP4的表达量。近期发现STEAP4在心功能障碍患者中明显减少,具有显著相关性。因此我们假设STEAP4可能在二甲双胍保护MIRI导致凋亡的过程中起到了一定的作用,最终减轻MIRI诱导的凋亡,保护心脏功能。总而言之,本课题旨在探讨二甲双胍对心肌缺血再灌注损伤的影响。将SD大鼠和H9c2细胞当成本实验的研究对象,通过建立SD大鼠在体缺血再灌注损伤模型及H9c2心肌细胞缺氧复氧模型,探讨下面两方面内容:(1)观察并分析二甲双胍预处理组在大鼠缺血再灌注损伤后是否对MIRI拥有保护作用;(2)应用RNA干扰技术低表达STEAP4的水平,观察二甲双胍对H9c2细胞缺氧复氧的保护作用,探讨二甲双胍发挥心肌保护作用的可能机制。研究方法:第一部分:本研究采用SD大鼠进行如下在体动物实验1、将60只雄性且健康的SD大鼠随机平均分成3组:(A)对照组(Control);(B)缺血再灌注组(ischemia reperfusion,I/R);(C)缺血再灌注+二甲双胍组(I/R+metformin)。C组的大鼠在缺血再灌注14天前根据老鼠体重按照250mg/kg的标准,将二甲双胍溶解于100μl生理盐水中进行腹腔内注射,每天一次。A组和B组注射同体积的生理盐水,同样每天一次,连续注射14天。B组和C组通过采用开胸结扎冠状动脉左前降支半小时,再灌注2小时的方法建立缺血再灌注模型。A组大鼠同样需要开胸及冠状动脉左前降支穿线,但不结扎及进行后续操作。2、大鼠心脏冠状动脉左前降支结扎后通过观察及分析心电图II导联ST段的变化判断心肌缺血模型是否建立成功,为后续心脏再灌注做准备。3、在心脏再灌注结束后,收集各组大鼠血清并通过ELISA法检测肌钙蛋白(troponin)及肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量鉴定心脏的损伤程度。4、通过TTC染色法明确SD大鼠缺血再灌注后心梗面积。5、通过原位末端转移酶标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)染色衡量心肌细胞的凋亡程度。6、采用苏木素伊红染色(hematoxylin and eosin,HE)评价心肌病理变化和损伤。第二部分:本研究采用体外培养H9c2细胞进行如下实验:1、建立心肌缺氧复氧模型:将正常状态(37℃、5%CO_2)下培养的H9c2细胞随机分成6组:(A)对照组(Control);(B)缺氧复氧组(hypoxia-reoxygenation,H/R),用Earle’s培养液(无血清及葡萄糖)替换正常培养基并放入缺氧培养箱中培养(37℃、5%CO_2、94%N_2)6小时,随后将Earle’s培养液换成正常培养基放入正常条件下(37℃、5%CO_2)培养4小时。(C)缺氧复氧+二甲双胍(10μM)组(H/R+metformin(10μM)),将二甲双胍溶解于培养基加入细胞培养板,二甲双胍(10μM)预处理细胞12小时后再进行缺氧复氧。(D)缺氧复氧+二甲双胍(20μM)组(H/R+metformin(20μM)),操作同C组。(E)缺氧复氧+二甲双胍(40μM)组(H/R+metformin(40μM)),操作同C组。(F)缺氧复氧+二甲双胍(80μM)组(H/R+metformin(80μM)),操作同C组。通过CCK-8实验检测各组细胞活性以及蛋白免疫印迹检测各组Bcl-2/Bax比例分析各组凋亡情况,确定二甲双胍预处理的最适作用浓度,以备后续实验。2、将正常状态(37℃、5%CO_2)下培养的H9c2细胞随机分成5组:(A)对照组(Control),不进行任何处理;(B)缺氧复氧组(hypoxia-reoxygenation,H/R),用Earle’s培养液替换正常培养基,并放入缺氧培养箱中培养(37℃、5%CO_2、94%N_2)6小时,随后将Earle’s培养液换成正常培养基放入正常条件下(37℃、5%CO_2)培养4小时。(C)缺氧复氧+二甲双胍组(H/R+metformin),将二甲双胍溶解于培养基加入细胞培养板,预处理细胞12小时后再进行缺氧复氧。(D)缺氧复氧+siNC+二甲双胍组(H/R+siNC+metformin),H9c2细胞瞬转siRNA NC,转染24小时后进行C组的处理。(E)缺氧复氧+siSTEAP4+二甲双胍组(H/R+siSTEAP4+metformin)H9c2细胞瞬转STEAP4 siRNA,转染24小时后进行C组的处理。2、台盼蓝染色法测定H9c2细胞生存率。3、流式细胞术衡量H9c2细胞凋亡率。4、罗丹明123(Rh123)染色测定H9c2细胞线粒体膜电位变化。5、Real Time PCR检测STEAP4及凋亡相关分子(Bcl-2、Bax)的mRNA表达水平。6、蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测大鼠心肌细胞和H9c2细胞的凋亡相关分子(Bcl2、Bax),线粒体凋亡相关分子(Cytochrome C、Cleaved Caspase9、Cleaved Caspase3),STEAP4以及PPAR-γ的表达情况。结果:1、各组心肌缺血再灌注大鼠的心电图II导联ST段在结扎后明显高于对照组。再灌注后大鼠心肌梗死相关标志蛋白CK-MB、troponin相较于对照组上升明显,而当二甲双胍预处理后这几个指标均有明显下降。2、各组心肌缺血再灌注大鼠心梗面积和细胞凋亡率明显高于对照组,而给与二甲双胍预处理组的心脏梗死面积及细胞凋亡率明显下降。3、缺血再灌注的大鼠心肌有纤维化形成,细胞间质水肿、炎症细胞浸入等病理变化,给与二甲双胍后可改善心肌损伤和缓解心肌病理改变。4、在缺血再灌注的大鼠中,STEAP4表达较正常组减少,同时促凋亡蛋白(Bax)表达增加,抗凋亡蛋白(Bcl-2)减少,而给与二甲双胍预处理后,逆转了这种情况。5、在H9c2细胞中我们发现二甲双胍40μM浓度时最能改善缺氧复氧损伤细胞状态。在H9c2细胞中我们同样发现和缺氧复氧组对比,二甲双胍预处理有改善缺氧复氧损伤作用,包括提升细胞生存率,减少细胞凋亡率,增加Bcl-2表达,减少Bax水平,增加STEAP4、PPAR-γ表达量,减少线粒体凋亡分子(Cytochrome C、Cleaved Caspase9、Cleaved Caspase3)表达水平,增加线粒体膜电位。6、当敲低STEAP4蛋白表达后部分逆转了二甲双胍对H9c2细胞在缺氧复氧下的保护作用,表现为抗凋亡蛋白(Bcl-2)下降,促凋亡蛋白(Bax)表达增加,PPAR-γ水平下降,线粒体膜电位下降以及线粒体相关凋亡相关分子(Cytochrome C、Cleaved Caspase9、Cleaved Caspase3)的激活。结论:1、二甲双胍可以有效减轻大鼠心肌细胞凋亡并改善心肌缺血再灌注损伤。2、二甲双胍可以改善H9c2细胞缺氧复氧损伤,抑制线粒体凋亡,激活STEAP4及PPAR-γ表达。因此,STEAP4/PPAR-γ相关的信号通路可能是二甲双胍对心血管系统多效性保护途径的一种新的解释。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R542.22
【图文】：

流程图,流程图,二甲双胍,发病率

中国医科大学博士学位论文，绘制偏倚风险图，见图 2。双胍治疗与格列美脲治疗糖尿病比较急性心肌梗死发病献比较了二甲双胍与格列美脲治疗糖尿病后 AMI 发病率，其 95（relative risk）可信区间是 0.71（0.57,0.88）。各研究中无统计学异%，P=0.25），采用固定效应模型，差异有统计学意义（P= 0.002）表明：二甲双胍治疗比格列美脲治疗糖尿病后急性心梗发病率低

偏倚,风险,森林图,患病率

纳入研究的风险偏倚图

患病率,森林图,治疗前后

治疗前后的AMI患病率森林图

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