CyPA-CD147在兔动脉粥样硬化模型血管重构中的表达研究
发布时间：2020-07-13 19:35
【摘要】：21世纪以来,随着各国居民的生活水平日益提高,生活压力增加,生活方式变化,心血管疾病成为了威胁国民生命健康安全的最主要一类疾病。2011年WHO的研究报道显示,全球每年约1730万人死于心血管病,而这种死亡率仍呈逐年递增的趋势,而居于致人类死亡的疾病谱首位。冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)是其中最常见的心血管疾病,也是人类健康的最大杀手。动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是冠心病的基本病理特征,是由于长期众多危险因素参与,触发、促进动脉管壁发生的慢性进展性炎症过程,从脂质沉积,内膜增厚,脂纹出现到血管狭窄动脉粥样硬化斑块形成,需要迁延十几年到几十年时间。目前关于动脉粥样硬化的形成机制仍不明确,存在许多假说,包括脂质浸润学说、血栓形成学说、血管内皮损伤学说和炎性反应学说。目前比较公认的是血管内皮损伤学说和炎性反应学说。即多种因素的刺激,对血管内皮造成损伤,血管内皮发生功能性及器质性的改变,加上血脂代谢紊乱,脂质经破损的血管内皮沉积到血管壁、平滑肌细胞间,引起平滑肌细胞的增殖。同时,平滑肌细胞及单核巨噬细胞吞噬脂质成为泡沫细胞,血小板也会聚集、沉积在受损的内皮,被暴露的胶原激活,释放血栓素等活性物质。而这些异常的成份具有较强的致炎作用,产生多种炎症因子,导致斑块内发生慢性炎症反应,使斑块逐渐增大。以上多种因素的复杂相互作用,触发机制参与了动脉粥样硬化的形成过程。动脉粥样硬化是一种进展性、不可逆的病理过程,在儿童期,血管即有脂纹等早期的动脉粥样硬化性改变。而直到中年,合并多种危险因素后才出现症状。因此,近年来,早期发现动脉粥样硬化的改变,进而早期预防、早期治疗已成为当前研究的一大热点。目前认为内皮功能障碍及血管重构(弹性减弱、僵硬度增加、内膜增生)是早期动脉粥样硬化的最主要的病理特征。同时,血管重构又能一定程度上反映内皮功能障碍,因此,探讨血管重构的改变,对动脉粥样硬化防治有重大的意义。血管重构是在血流动力学及体液因子相互作用下引发的血管结构的慢性改变,是血管为适应体内外环境变化而导致的结构及功能性的动态改变过程。它既是动脉粥样硬化过程的病理变化,又是动脉粥样硬化得以持续及进展的结构基础。血管平滑肌细胞的迁移,增殖与凋亡,细胞外基质的降解与重新分布是血管重构的基本病理变化。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase MMPS)是一种酶活性依赖锌离子的蛋白酶超家族,根据结构及底物特异性,可将其分为胶原酶、胶质溶解素、膜结合型MMPS、胶原酶(MMP-2、MMP-9).胶原酶能降解细胞外基质(Extracellular matrix ECM),在动脉粥样硬化和血管重构过程中都发挥着重大作用。ECM是血管壁的重要组成部分,它处于不断合成与分解的动态平衡中。MMPS能降解ECM,使新的ECM不断合成,修复,从而使胶原过多沉积,管壁增厚,失去弹性。同时也能促进血管平滑肌细胞向内膜迁移,导致内膜增厚,发生心血管重构。CD147又称为基质金属蛋白酶诱导因子,是免疫球蛋白超家族成员之一的一种跨膜糖蛋白,广泛表达于包括内皮细胞、造血细胞、肿瘤细胞在内的多种生理细胞及病理细胞内。亲环素A(Cyclophilin A,cyPA)是一种亲环素蛋白,是免疫抑制剂环孢素在胞内的作用靶点,除调节免疫功能外,还能参与细胞信号传导,调节细胞的生存与凋亡。CD147是CyPA受体,又是基质金属蛋白酶诱导剂,CyPA与CD147形成的复合物在巨噬细胞及内皮细胞的作用下,通过细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)和核转录因子(NF-κB)及其抑制剂(IκB)的信号途径,促进MMPS的释放,降解细胞外基质,引起心血管的重构。同时,CyPA-CD147的结合,还能通过激活ERK1/2和AK/STAT信号途径,活化平滑肌细胞,引起平滑肌细胞增殖,进一步导致血管重构。目前,国内外关于CyPA-CD147领域的研究多集中于肿瘤及风湿领域,在动脉粥样硬化领域的鲜有研究。而就CyPA-CD147的表达在动脉粥样硬化血管重构中尚未有相关研究报到。本研究旨在通过建立兔动脉粥样硬化模型,测定CyPA-CD147在模型中的表达,探索模型中的血管重构情况,并分析二者的相关性,进而早期发现动脉粥样硬化的改变,为早期预防、早期治疗提供理论依据,从而减少急性心血管事件发生,降低发病率、致残率及致死率。目的1、利用液氮冻伤结合高脂饮食建立兔动脉粥样硬化的动物模型,探讨兔动脉粥样硬化模型血管重构情况。2、HE染色、弹力纤维染色及MASSON染色分析兔血管内膜及斑块形态,测定CD147、CyPA、MMP-9血清学指标变化,免疫组化分析三项指标在血管中表达特点。测定CD147、CyPA在血管中的mRNA表达差异。3、采用病理图像分析系统分析血管重构的相关指标变化,将血清CD147、CyPA的表达与血管重构进行相关回归分析。方法1、构建动物模型：按简单随机方法将32只健康雄性新西兰白兔分为对照组、液氮冻伤组、高脂饮食组、模型组,每组8只。对照组持续普通饮食,不做任何处理；模型组利用液氮冻伤血管内膜结合高脂饮食的方法建立动脉粥样硬化模型；液氮冻伤组予以液氮冻伤血管内膜后持续普通饮食；高脂饮食组持续高脂饮食,血管不做任何损伤处理。2、血清学指标测定：分别于实验开始前、高脂饮食第13周(实验结束前),采集各组兔外周血,利用酶联免疫吸附法(ELISA)测定各组CD147、CyPA、MMP-9等水平。3、病理组织观察：4组实验动物于术后13周处死,每组取造模处或相对应血管的一部分(约4cm),常规石蜡包埋切片,分别作HE染色、弹力纤维染色、Masson染色,普通光镜下观察组织病理学变化,并利用CyPA、CD147、VCAM11单克隆抗体进行免疫组织化学染色。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测血管CD147mRNA和CyPAmRNA的表达差异。4、计算机病理图像分析系统(Image-proplus 6.0)分析血管重构参数血管组织切片进行弹力纤维染色后,采用病理图像分析系统分析颈动脉外弹力层围绕面积(EELA)、内弹力层围绕面积(IELA)、管腔面积(LA)、最小管腔直径(MLD)、最大内膜厚度(MIT)、内膜面积(IA)、中膜面积(MA)、管腔狭窄度(LS)。5、统计学分析：所得数据采用SPSS 13.0软件进行统计分析,计量资料均采用均数±标准差的方式表示。多组样本总体均数比较采用One-way ANOVA分析。方差齐时多组样本均数间的多重比较运用LSD-t检验,方差不齐的样本均数间的多重比较运用Dunnett'sT3方式检验。同组样本间的前后比较采用配对t检验。认为P0.05为差异有统计学意义。结果1、兔总体生长情况兔总体生长良好,模型组的1只新西兰白兔因麻醉过量死亡,液氮冻伤组的1只死于术中大出血,其余动物全部完成实验,所得30只动物数据参与分析。2、血清学指标测定血清CD147测定：实验前,4组兔血清CD147水平差异无统计学意义(P0.05)。在对照组,与实验前相比,血清CD147水平在第13周无明显差异(P0.05)；在模型组,与实验前相比,血清CD147水平在第13周明显升高,差异有统计学意义(P0.05)；在液氮冻伤组,与实验前相比,血清CD147水平在第13周明显升高,差异有统计学意义(P0.05)；在高脂饮食组,与实验前相比,血清CD147水平在第13周明显升高,差异有统计学意义(P0.05)。4组间第13周血清CD147水平相比,有明显差异,差异有统计学意义(P0.05),且在模型组中表达较另外3组明显升高。血清CyPA测定：实验前,4组间兔血清CyPA水平差异无统计学意义(P0.05)。在对照组,与实验前相比,血清CyPA水平在第13周无明显差异(P0.05)；在模型组,与实验前相比,血清CyPA水平在第13周明显升高,差异有统计学意义(P0.05)；在液氮冻伤组,与实验前相比,血清CyPA水平在第13周明显升高,差异有统计学意义(P0.05)：在高脂饮食组,与实验前相比,血清CyPA水平在第13周明显升高,差异有统计学意义(P0.05)；4组间第13周血清CyPA水平相比,有明显差异,差异有统计学意义(P0.05),且在模型组中表达较另外3组明显升高。血清MMP-9测定：实验前,4组间兔血清MMP-9水平差异无统计学意义(P0.05)。在对照组,与实验前相比,血清MMP-9水平在第13周无明显差异(P0.05)；在模型组,与实验前相比,血清MMP-9水平在第13周明显升高,差异有统计学意义(P0.05)；在液氮冻伤组,与实验前相比,血清MMP-9水平在第13周明显升高,差异有统计学意义(P0.05)；在高脂饮食组,与实验前相比,血清MMP-9水平在第13周明显升高,差异有统计学意义(P0.05);4组第13周血清MMP-9水平相比,有明显差异,差异有统计学意义(P0.05),且在模型组中表达较另外3组明显升高。3、免疫组化分析对照组内膜光整,可见散在少量巨噬细胞分布,未见CyPA、CD147、MMP-9抗体的表达；中膜可见规整平滑肌细胞,未见明显CyPA、CD147、MMP-9及RAM11抗体表达。模型组增生内膜及斑块内可见CyPA、CD147、MMP-9呈片状分布表达,且表达具有同区域分布的特点。与同一血管同一部位的巨噬细胞抗体染色对比显示,CyPA、CD147、MMP-9表达多集中于巨噬细胞聚集部位。液氮冻伤组内膜轻度增生,中膜光滑规整,增生内膜可见CyPA、CD147、MMP-9的散在表达。同时,可见三者表达区域相同。高脂饮食组CyPA、CD147、MMP-9在增生内膜内散在少量表达,内膜未增生区域跟对照组相似,无表达。4、RT-PCR检测CD147 mRNA的表达：在模型组、液氮冻伤组及高脂饮食组较对照组的表达明显升高。4组间CD147mRNA表达对比有明显差异,差异有统计学意义(P0.05),且在模型组中表达较另外3组明显升高。CyPA mRNA的表达：在模型组、液氮冻伤组及高脂饮食组较对照组的表达明显升高。4组间CyPA mRNA表达对比有明显差异,差异有统计学意义(P0.05),且在模型组中表达较另外3组明显升高。5、血管重构指标测定模型组、液氮冻伤组、高脂饮食组较对照组,内膜明显增厚,管腔明显缩小,中膜面积明显增厚,管腔狭窄度明显增大,差异有统计学意义(P0.05)。4组内膜面积(IA)相比,有明显差异,差异有统计学意义(F=22.54,P0.05),且在模型组中IA较另外3组明显增厚；4组管腔面积(LA)相比,有明显差异,差异有统计学意义(F=8.61,P0.05),且在模型组中LA较另外3组明显缩小；4组管腔狭窄度(LS)相比,差异有统计学意义(F=458.00,P0.05),且在模型组中LS较单纯冻伤及高脂饮食明显增加。结果表明,动脉粥样硬化的模型组较液氮冻伤组、高脂饮食组和对照组,IA、LS明显增大,LA明显减小。结论兔动脉粥样硬化模型血管内膜明显增生增厚,管腔明显狭窄。CD147、CyPA、MMP-9在兔动脉粥样硬化模型的血清、斑块及增生内膜的表达明显升高。且CD147、CyPA的表达越高,内膜增生及血管狭窄越重,血管重构越明显。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R543.5;R-332
【图文】：
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本文编号：2753883
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R543.5;R-332
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