心衰后室颤大鼠中NLRP3炎症小体影响心肌细胞Nav1.5表达的机制研究

发布时间：2020-07-16 22:42

【摘要】：背景:心力衰竭的基本机制是心室重构。心力衰竭不仅存在心室的结构重构,还有离子通道分子水平的电重构,这种电重构可能与心衰后心室颤动相关。心室的结构重构主要体现在心肌肥厚和心肌纤维化等方面。NLRP3炎症小体是关键的炎症反应调控因子,其核心蛋白NLRP3与Caspase 1、ASC形成复合体能促进活化经典炎症分子IL-1β,同时也参与调控典型的促纤维化因子TGF-β。NLRP3能介导心肌细胞的炎症联级反应、诱导心肌细胞焦亡和纤维化。但NLRP3影响Nav1.5的表达与否与具体机制皆有待研究。目的:建立心力衰竭模型后,诱发大鼠室颤,探究NLRP3和Nav1.5的表达是否有变化,在此基础上,探讨NLRP3炎症小体通过IL-1β及TGF-β介导调控心肌细胞Nav1.5蛋白表达水平的机制。方法:1.大鼠随机分手术组(腹主动脉缩窄术)和假手术组,行大鼠心脏彩色超声评价大鼠心功能。在建立心力衰竭模型的基础上,经食道电刺激诱发大鼠室颤,同等诱发条件刺激假手术组。取两组大鼠左心室心肌组织行Western Blotting检测Nav1.5和NLRP3核心蛋白的表达。2.利用vehicle、NLRP3-shRNA、IL-1β-shRNA、TGF-β-shRNA腺病毒稳定转染和两种病毒共同转染H9C2大鼠心肌细胞系,细胞分为6组:1)LV-shRNA组(转染了vehicle的空载病毒,即对照组);2)NLRP3-shRNA组;3)IL-1β-shRNA组;4)TGF-β-shRNA组。此四组为单个病毒转染组。5)NLRP3-IL-1β-shRNA组;6)NLRP3-TGF-β-shRNA组,此两组为在成功转染NLRP3病毒的基础上再继续转染IL-1β或TGF-β病毒。RT-PCR及荧光标记蛋白表达观测鉴定转染情况。3.检测6组细胞中的Nav1.5、NLRP3、IL-1β、TGF-β、ASC和Caspase 1蛋白表达水平,免疫荧光观察LV-shRNA组和NLRP3-shRNA组中Nav1.5的分布和表达。探究NLRP3与TGF-β、IL-1β的关系以及各炎症因子对Nav1.5的表达的影响。数据统计使用SPSS 21.0处理,Western Blotting灰度值选择Adobe Photoshop CS6计算,小提琴图和柱状图分别采用R 3.5和GraphPad Prism5制作。心脏超声各指标用均数±标准差来表示,多组间连续性变量之间的比较采用单因素方差分析,两组间的连续性变量则使用两独立样本t检验。P0.05认为有统计学差异。结果:1.腹主动脉缩窄术8周后,心脏彩超显示大鼠的左室射血分数、左室短轴缩短率和心输出量与假手术组相比明显降低,暗示心衰大鼠模型构建成功。12V的电压刺激16秒,心力衰竭大鼠稳定诱发心室颤动,同等条件下假手术组无心室颤动发生。室颤大鼠左心室心肌中NLRP3核心蛋白的表达比对照组高,反之,Nav1.5比对照组要低。2.一次转染组转染效率检测:LV-shRNA组、NLRP3-shRNA组、IL-1β-shRNA组、TGF-β-shRNA组镜下荧光显示转染成功。两种病毒共转组转染效率检测:经RT-PCR检测NLRP3-IL-1β-shRNA组中IL-1β和NLRP3-TGF-β-shRNA组中TGF-β的表达量,发现与对照组相比,IL-1β和TGF-βmRNA表达量分别被抑制,且镜下荧光蛋白表达良好,表明各组转染成功。3.与LV-shRNA组相比,NLRP3-shRNA组、NLRP3-TGF-β-shRNA组和IL-1β-shRNA组的Nav1.5的表达量皆上调了,且NLRP3-TGF-β-shRNA组比NLRP3-shRNA组上调得更加明显,而NLRP3-IL-1β-shRNA组并不上调。IL-1β-shRNA组是在所有沉默组中表达最高的,NLRP3沉默之后,使Nav1.5的蛋白含量增加的同时,伴随着NLRP3、ASC、Caspase 1以及TGF-β和IL-1β等炎症因子同期下调。IL-1β和TGF-β病毒转染以后,NLRP3的蛋白含量反而升高,而NLRP3-TGF-β-shRNA组发生下调。各实验组IL-1β、TGF-β表达比空载病毒组皆低,且各组中基本检测不到成熟的TGF-β。IL-1β-shRNA组相较于NLRP3-IL-1β-shRNA组,NLRP3、ASC、Caspase1、IL-1β、pro-IL-1β及pro-TGF-β的表达皆被抑制,Nav1.5则被促进。另外,ASC和Caspase 1在各组的表达时高时低、并不完全同步,无目前尚无明确规律可循,但ASC和Caspase 1分别在在NLRP3-TGF-β-shRNA组和NLRP3-shRNA组中表达最为积极,两者在IL-1β沉默的组中下调最为明显。4.免疫荧光显示Nav1.5在NLRP3沉默组表达丰度明显增加。结论:1.经腹主动脉缩窄术8周后可成功构建心力衰竭模型,12V的电压经食道刺激16秒可诱发心衰大鼠发生室颤。2.NLRP3、IL-1β、TGF-β皆参与对Nav1.5蛋白表达的调控,NLRP3可直接下调Nav1.5的表达。且NLRP3炎症小体通过TGF-β介导抑制心肌细胞Nav1.5的表达水平,然则通过IL-1β的可能性比较小,但IL-1β对Nav1.5的直接阻遏作用十分明显。3.ASC和Caspase 1在各组中蛋白表达水平与NLRP3趋势不一致。NLRP3、IL-1β、TGF-β、Caspase 1、ASC炎症因子之间相互影响。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R541.6;R541.75
【图文】：

室颤,心衰

心衰组和对照组诱发所需的电压和时间不同，且同一组的各只大鼠之中有差异，心衰一般为12V，16秒，假手术组所需的电压和时间都更低。图1-2 室颤前后和刺激时心电图波形Figure1-2.ECG monitoring waveform of before and after ventricular fibrillation as well as the stimulation.3.3 WB结果本实验在心衰后室颤组和假手术非室颤组中进行了蛋白表达水平的研究，研究显示，与对照组相比，NLRP3表达明显增高（P<0.0001），而Nav1.5的表达明显降低（P<0.0001）。条带清晰完整具有统计学意义。

浓度,嘌呤霉素

嘌呤霉素浓度筛选结果

心肌细胞,转染,感染剂量,机制研究

心衰后室颤大鼠中 NLRP3 炎症小体影响心肌细胞 Nav1.5 表达的机制研究 2019 届硕士研究生学位论文3.2 细胞稳定转染最佳病毒 MOI如下图所示（图 2-2），摸索 H9C2 心肌细胞的最佳转染 MOI，使用浓缩的腺病毒分别以 MOI=5, MOI=10, MOI=40 的梯度进行转染，最佳感染剂量是细胞感染效率的 80％或更高。如图所示，最终所需 MOI 值为 40。

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