钙调蛋白在缺氧诱导心脏成纤维细胞自噬与凋亡中分子机制研究

发布时间：2020-07-17 04:50

【摘要】：缺血性心脏病主要由于冠状动脉粥样硬化导致血管狭窄或堵塞,从而引起心脏缺血和下游组织缺氧。其中缺氧是一种存在于多种心血管疾病中的病理特征,在介导心脏重构和心脏细胞的多种生物学功能方面起到重要作用,特别是缺氧能够广泛促进心脏中细胞的凋亡。目前,大多数研究都关注心肌细胞的凋亡,对心脏成纤维细胞(cardiac fibroblast,CF)凋亡的报道较少。然而,CF是心肌修复的关键因素,可以产生胶原蛋白,提高心脏的拉伸强度。纤维化修复受到破坏则会导致心脏壁拉伸强度降低。但损伤后CF的持久存在则会导致瘢痕、不良重塑、心肌肥大、心律失常、心力衰竭等。因此寻找抑制成熟期CF凋亡的机制研究能够为损伤后的修复提供了理论依据和分子靶标。钙调蛋白(Calmodulin,CaM)是一种17 KDa的钙结合蛋白,在真核细胞中广泛存在。CaM能够通过结合包括激酶、磷酸酶、离子通道、转录因子等许多靶蛋白,从而调节细胞兴奋-收缩耦联、参与心率失常相关信号转导等;而CaM过度活化会导致心力衰竭、心肌肥大等。因此,CaM在人体尤其是心脏中至关重要。而关于CaM在CF中作用的研究较少,尚不清楚在缺氧条件下CaM对于CF的作用以及机制。鉴于鞘氨醇磷酸胆碱(Sphingosylphosphorylcholine,SPC)具有广谱的抑凋亡功能,也具有广泛的促自噬作用;本实验室之前的研究结果显示SPC能够通过促进缺血模型下心肌细胞的自噬从而抑制凋亡,而且,CaM是SPC的一种受体。因此我们拟对CaM在缺氧诱导CF自噬与凋亡中分子机制以及SPC在CF中是否具有与心肌细胞同样的作用等问题进行初步研究。结果显示,缺氧处理诱导CF的凋亡,用SPC处理缺氧条件下的CF,能够促进CF自噬,作用的靶点发生在自噬流。同时,SPC具有抑制CF凋亡的功能,说明在缺氧条件下SPC可能通过促进CF自噬的方式,避免细胞进入凋亡途径,从而抑制CF凋亡的发生。利用siRNA干扰技术,建立了干扰CaM表达的实验体系。发现干扰CaM的表达或抑制它的功能都可以增加CF的自噬而抑制其凋亡,说明CaM在CF的自噬和凋亡过程中发挥作用;SPC的功能与CaM抑制剂三氟拉嗪(Trifluoperazine,TFP)类似,同时添加SPC和TFP有叠加的效果;而SPC与Ca2+-ATPase抑制剂(能够导致细胞内Ca2+浓度升高)TG的作用相反,说明SPC通过CaM参与了对CF自噬和凋亡的调控过程。进一步研究发现,缺氧处理会引起CF中p38和STAT3磷酸化水平增加,SPC处理CF可抑制此过程,同时伴随着对CF凋亡的抑制。用p38抑制剂SB 253080、STAT3的抑制剂stattic以及STAT3的激动剂TFA进行平行实验,均证明了上述结果。由此说明,SPC可通过抑制p38/STAT3的磷酸化从而抑制缺氧诱导的CF凋亡。另外,CaM受抑制后,p38和STAT3的磷酸化水平也下降。综合以上结果,我们认为SPC可能通过其受体CaM调节p38和STAT3的磷酸化,从而直接或通过增强自噬来抑制缺血条件下CF凋亡。SPC对CF细胞和心肌细胞作用的同质性,为研究和将来治疗缺血性心血管疾病提供了较好的材料,SPC对CF细胞具有的增强自噬、抑制凋亡方面的功能,也为研究心血管疾病发生后心脏重塑的分子机制提供了思路。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R541
【图文】：

图２邋ＳＰＣ抑制缺氧诱导的ＣＦ凋亡。（Ａ）分别用１、５、１０邋ｐＭ邋ＳＰＣ处理ＣＦ，移逡逑入三气培养箱中缺氧４邋ｈ，普通光学显微镜下观察ＣＦ形态学变化并拍照。（Ｂ）逡逑将ＣＦ按照Ａ的方法处理，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ检测ＰＡＲＰ１和ｃａｓｐａｓｅ３切割水平的变化。逡逑（Ｃ）按照Ａ方法处理后的细胞进行Ｈｏｅｃｈｓｔ邋３３２５８染色，使用荧光显微镜拍照。逡逑Ｎｏｒ为正常条件培养组，Ｃｔｒ为缺氧对照组。＊Ｐ＜０．０５；邋＊＊Ｐ＜０．０１；邋＊＊＊Ｐ＜０．００１。逡逑ｎ＝３0逡逑

邋ＳＰＣ促进ＣＦ自噬。（Ａ）分别用１、５、１０邋ｈＭ邋ＳＰＣ处理，移入三气培养氧４邋１１，提蛋白使用”６切６１１１５１0１检测１＾：３－１１表达的变化。（８）使用３－＾１八）邋ＢａｆＡｌ和ＳＰＣ共同处理，之后进行缺氧处理，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ检测ＬＣ３－ＩＩ变化。ｖｅｈｉｃｌｅ邋均为溶剂对照。＊Ｐ＜０．０５；邋＊＊Ｐ＜０．０１；邋＊＊＊Ｐ＜０．００１。ｎ＝３。逡逑

图４抑制ＣａＭ能够抑制缺氧诱导的ＣＦ凋亡。（Ａ）分别使用２０、４０、６０、８０邋ｎＭ逡逑的ＣａＭ邋ｓｉＲＮＡ处理ＣＦ，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ检测ＣａＭ的表达量。（Ｂ）分别使用ＣａＭ逡逑的ｓｉＲＮＡ和ＳＰＣ共同处理，缺氧处理４邋ｈ，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ检测ＰＡＲＰ１和ｃａｓｐａｓｅ３逡逑切割水平的变化。（Ｃ）使用ＣａＭ的ｓｉＲＮＡ和ＳＰＣ共同处理之后用Ｈｏｅｃｈｓｔ邋３３２５８逡逑染色，荧光显微镜下观察拍照。ｓｉＣ为ＣａＭ的ｓｉＲＮＡ，ｖｅｈｉｃｌｅ均为溶剂对照，逡逑ｎｅｇ邋为阴性对照。叩＜０．０５；邋＊叩＜０．０１；邋Ｍ＋ＰｃＯ．ＯＯｌ。ｎ＝３。逡逑

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