Calpain-I通过Junctophilin-2影响房颤发生的研究

发布时间：2020-07-19 02:45

【摘要】：一、研究背景心房颤动(Atrial fibrillation,AF)是最严重的心房电活动紊乱,也是临床上最常见的心律失常。关于AF的具体发生机制尚未完全明确,这严重制约着临床上AF治疗的有效性及安全性。大量研究表明,心房肌细胞内钙稳态异常,特别是钙泄漏是AF发生、发展的重要机制之一。而钙稳态主要受到心肌细胞肌浆网(Sarcoplasmic reticulum,SR)上雷尼丁受体(Ryanodine receptor 2,RyR2)的调控。RYR2作为最主要的钙释放通道,在心肌的舒张期应保持理想的关闭状态。如舒张期RyR2异常开放,会引起肌浆网的钙泄漏(Ca~(2+)leak)增多,Ca~(2+)通过胞膜上的钠钙交换体(NCX)外排,产生异常的净内向阳离子移动,进而导致心肌细胞延迟后除极(Delayed afterdepolarization,DAD)。一旦达到心肌细胞兴奋的阈值,即可诱发自发性的动作电位(action potential,AP);如多处心肌细胞同步出现自发AP等异位电触发活动,在业已存在心房扩大或纤维化等心房重构基质的基础上,则可引发AF。晚近研究发现,RyR2的稳定性受到亲联蛋白(Junctophilin,JPH)-2(JPH2)的调控,JPH2可通过和RyR2结合对影响RyR2的稳定性。近来研究发现,快速心房搏动导致心肌细胞内钙浓度增加,可激活Calpain-Ⅰ,而且其激活程度随AF持续时间的延长而逐渐增高,因此我们推测,高频率心房搏动可导致心房肌细胞内Ca~(2+)超载,进而可能激活Calpain-Ⅰ,降解JPH2蛋白,导致钙泄漏增多,最终引发AF的发生。本研究拟通过临床及动物研究明确在AF发生中Calpain-Ⅰ与JPH2蛋白水平的相关关系。二、研究目的1、明确Calpain-Ⅰ/JPH2与人房颤发生的相关性;2、明确快速心房起搏通过诱导Calpain-Ⅰ/JPH2表达变化,影响钙稳态,导致房颤的发生。三、研究方法(一)房颤患者左心房Calpain-I与JPH2的表达变化研究1、研究对象选取在海军军医大学附属长征医院心脏外科行瓣膜手术的患者64例,所有患者签署手术知情同意书及剩余标本使用知情同意书。2、研究分组根据患者病史及术前心电图将患者分为两组:房颤组(AF组,n=32)和窦性心律组(SR组,n=32)。3、标本及临床资料采集收集手术中切除的左心房(LAA)及所有入院患者的一般临床资料。4、分子生物学指标检测(1)采用组织块酶消化及荧光染色的方法,评价心房肌细胞胞内钙离子浓度;(2)利用试剂盒检测不同分组心房肌组织Calpain-Ⅰ酶活;(3)性采用Q-PCR方法检测不同分组JPH2 mRNA表达水平:(4)采用Western blot方法检测不同分组JPH2及Calpain-Ⅰ蛋白表达水平;(二)左心房Calpain-Ⅰ/JPH2蛋白水平相关性及其与房颤发生的动物实验研究1、兔AF模型的建立与鉴定(1)研究对象:成年新西兰大白兔,体重约2.0-2.5kg;(2)模型制备及实验分组:开胸将刺激电极缝合与左心耳表面,用阈上刺激连续刺激,观察刺激有效后关胸。手术组依据实验要求分为RAP组和RAP+Calpain-Ⅰ抑制剂组,RAP组在术后1w后开始RAP连续起搏4w,同时予以腹腔注射二甲基亚砜制剂(DMSO,MDL28170的溶剂),连续给药4w。RAP+Calpain-Ⅰ抑制剂组在术后1w后开始RAP连续起搏4w,同时腹腔注射带有MDL28170(Calpain-Ⅰ特异性抑制剂)的溶液,连续给药4w。假手术组仅进行开关胸操作,在术后1w后开始腹腔注射DMSO,连续给药4w;(3)模型鉴定:利用遥测系统记录兔AF发生情况及持续时程(5min为持续性AF,5min并且能够自行终止者为非持续性AF或阵发性AF)。2、标本采集术后5周处死实验动物,部分用于分离心肌细胞,部分用于分子生物学指标检测。3、分子生物学研究(1)利用试剂盒检测不同分组Calpain-Ⅰ酶活性;(2)采用Q-PCR方法检测不同分组JPH2 mRNA表达水平;(3)采用Western blot方法检测不同分组JPH2及Calpain-Ⅰ蛋白表达水平;(4)采用Langendorff灌流及荧光染色法,评价心房肌细胞内钙离子浓度:(三)统计学方法所有数据采用SPSS 21.0进行统计分析,P0.05表示差异存在统计学意义。四、研究结果(一)房颤患者左心房Calpain-I与JPH2的表达变化研究1、AF组与SR组患者一般临床资料无明显差异(P0.05);但AF患者LAD明显大于SR组患者(53.97±8.37 vs 41.81±8.18,P0.05)。2、AF组心肌细胞内钙离子相关的荧光强度明显高于SR组,且AF组细胞内平均荧光强度明显高于SR组(20.56±1.98 vs 8.92±1.26,P0.01)。3、以SR的OD值为基准,AF组Calpain-Ⅰ酶活性明显高于SR组(P0.05)。4、以SR组的mRNA表达量为基准,AF组患者左心房肌组织中JPH2 mRNA的表达水平与SR组差异无统计学意义(P0.05)。5、AF组JPH2蛋白表达较SR组明显下调(0.53±0.14 vs 0.82±0.27,P0.01);但AF组Calpain-Ⅰ蛋白表达较SR组显著上调(0.89±0.09 vs 0.46±0.09,P=0.015)。6、AF组左心房肌JPH2蛋白水平与Calpain-Ⅰ酶活性呈现明显负相关(P0.01)。(二)左心房Calpain-Ⅰ/JPH2蛋白水平相关性及其与房颤发生的动物实验研究1、Calpain-Ⅰ抑制剂可降低RAP导致的房颤发生率(P0.01)。2、Calpain-Ⅰ抑制剂可降低RAP导致的酶活性增加(P0.01)。3、Calpain-Ⅰ抑制剂对JPH2 mRNA表达水平无影响(P0.05)。4、Calpain-Ⅰ抑制剂可抑制RAP导致的JPH2蛋白降解(P0.05)。5、房颤兔心房肌中JPH2蛋白水平与Calpain-Ⅰ酶活性呈现明显负相关(P0.01)。6、Calpain-Ⅰ抑制剂可降低RAP导致的心肌细胞内钙离子浓度增加(P0.01)。五、研究结论(一)Calpain-Ⅰ/JPH2与人房颤发生密切相关;(二)Calpain-Ⅰ可通过降解JPH2蛋白,影响心房肌细胞内钙稳态,诱发房颤的发生。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R541.75
【图文】：

文- 12 -s）、钙波 （Ca2+wave）等，从而导致胞质稳态[17,18]。在这种情况下（图 1），Ca2+通胞外的 Na+以 1:3 的比例进行交换，会产生流（Transient inward current, Iti），进而导olarization, DAD）。一旦达到心肌细胞兴奋ction potential, AP）；如多处心肌细胞同步出存在心房扩大或纤维化等心房重构基质的

Calpain-I 通过 Junctophilin-2 影响房颤发生的Ca2+release unit, CRU）超微结构，调控 SR 钙循环平衡，保障心脏正常功要作用[26][27][28]。Hou 等[29]采用双荧光随机光学重建显微镜（Dual-cM）观察大鼠心肌细胞，结果提示 RyR2 簇与同样呈簇状排列的 JPH2 距在大约 80%的部位两者表现为空间共定位；Song 等[30]报道，JPH2 参与心结构重构及钙稳态异常，在心肌肥大导致心力衰竭的发展过程中发挥重用 JPH2-E169K 突变的肥厚性心肌病患者心房肌标本进行研究发现，RyR合减少，RyR2 通道开放概率（open probability, Po）增大，肌浆网异常增多（图 2）[24]。提示 JPH2 能和 RyR2 结合，并可能对 RyR2 稳定性发。那么，JPH2 蛋白表达水平的变化又究竟受何种因素的调节进而影响 A？

图 3: 两组患者左心房肌细胞内钙离子荧光强度光扫描共聚焦显微镜图像处理软件和 imagej 软件计算两组患者心强度与细胞面积的比值（平均荧光强度）（如图 4，表 2），AF 组度明显高于 SR 组（20.56±1.98 vs 8.92±1.26 , P＜0.01）。SR AFSR AF

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本文编号：2761786