【摘要】：树突状细胞(Dendritic cells,DCs)是机体免疫系统功能最强大的抗原提呈细胞(Antigen-presenting cells,APC),能够启动适应性免疫反应和炎性反应。DCs是一类异质性细胞群体,根据其分化状态可分为成熟DCs和未成熟DCs。从表型上来看,成熟DCs高表达MHC-II类分子、CD80、CD86及CD83分子;未成熟DCs中这些分子的表达水平则相对较低。从功能上来看,成熟DCs具有强大的抗原提呈功能,不具备摄取功能;而未成熟DCs则具备较强的摄取功能,不具备抗原提成功能,且能够诱导免疫耐受。有报道指出,在心肌缺血和病毒性心肌炎中,病灶内有DCs浸润。此外,DCs能够调节炎性反应,参与心肌组织损伤的修复过程。已有文献报道,DCs的成熟、分化及功能与其组蛋白乙酰化水平密切相关。曲古菌素A(Trichostatin A,TSA),是一种广谱的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histone deacetylase inhibitors,HDACIs)。我们前期工作证明,TSA能够参与心肌组织修复过程,减小大鼠心肌梗死面积,减轻心肌损伤。在TSA促进心肌组织损伤修复过程中,浸润至心肌组织中的DCs数量明显升高。但TSA对DCs有何作用,尚不十分明确。有研究表明,局部浸润的DCs多为成熟DCs。因此,我们推测TSA能够影响心梗后氧糖剥夺环境中DCs的成熟与功能。同大多数细胞一样,在正常情况下,DCs通过氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation,OXPHOS)产生能量。有研究表明,DCs在缺氧条件下,会进行代谢重编程,如糖酵解增强。丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)是糖酵解过程中的关键酶之一。M1型丙酮酸激酶(PKM1)能够促进线粒体内丙酮酸氧化生成乙酰辅酶A(Acetyl-CoA);而M2型丙酮酸激酶(PKM2)能够促进缺氧诱导因子1α(Hypoxia-inducible factor 1α,HIF1α)的表达,诱导乳酸脱氢酶A(Lactic dehydrogenase A,Ldha)的产生,Ldha可以催化丙酮酸生成乳酸。此外,有报道指出,心肌缺血大鼠心脏中PKM2的表达增加,能够改善大鼠心肌缺血损伤。因此,我们推测:在心肌缺血后氧糖剥夺环境中,TSA能够通过影响DCs的糖酵解过程中PKM2的表达,改变DCs的表型和功能,发挥心肌保护作用。研究目的:本研究将以小鼠dc2.4细胞系为研究对象,应用体外氧糖剥夺条件,模拟心肌梗死后组织氧糖剥夺环境,观察tsa对dc2.4细胞的表型与功能的影响,揭示心梗时tsa保护心肌的作用机制,从而为心肌缺血疾病的治疗提供新的理论依据。实验方法:以dc2.4细胞系为研究对象,通过mtt实验检测氧糖剥夺条件下不同时间及不同tsa浓度作用的细胞存活率,分组包括:对照组(control组),单纯缺糖组(gd),单纯缺氧组(od)以及氧糖剥夺组(ogd);每个模型分别给予4个tsa给药剂量:200nm、400nm、800nm、1000nm;时间设置为:24h,12h,8h以及4h,以确定氧糖剥夺时间、气体条件以及tsa的工作浓度;采用流式细胞术,检测在确定的给药浓度和给药时间条件下,tsa对氧糖剥夺条件下dc2.4细胞表型的影响。以fitc-dextran作为dc2.4细胞摄取物,检测tsa对氧糖剥夺条件下dc2.4细胞抗原摄取功能的影响;采用细胞划痕实验,观察tsa对氧糖剥夺条件下dc2.4细胞迁移能力的影响;应用elisa检测试剂盒,检测tsa对氧糖剥夺条件下dc2.4细胞上清液中il-1β、il-10、il-12和tgf-β细胞因子分泌的影响;采用atp和乳酸检测试剂盒,检测tsa对氧糖剥夺条件下dc2.4细胞产生atp和乳酸的含量的影响;采用western-blot技术检测氧糖剥夺条件下dc2.4细胞中pkm1/pkm2以及上游剪接因子srsf3的表达情况;采用rt-qpcr的检测方法,检测tsa对氧糖剥夺条件下dc2.4细胞内pkm1/pkm2和srsf3的mrna表达的影响,同时检测tsa对糖酵解相关基因tpi1、hk2、ldha和hif-1α的mrna表达的影响;应用shrna干扰srsf3和pkm2基因的表达,检测干扰srsf3后氧糖剥夺条件下dcs表达pkm2的情况,以及tsa对该条件下dcs产生atp和乳酸及分泌细胞因子的影响。实验结果:(1)tsa对氧糖剥夺条件下dc2.4细胞的保护作用:mtt结果显示:缺氧时间在8h及以上时,细胞存活率过低,分别为8h:(32.03±1.04)%;12h:(12.19±3.35)%;24h:(8.56±2.29)%;因此,确定tsa在常氧、给药时间低于12h时对细胞存活率无影响后,确立ogd模型的缺氧时间为4h(存活率为:44.76±2.34%)。同时,我们发现tsa200nm作用4h后,dcs存活率达到(70±3.11)%,因此,确定tsa给药浓度为200nm。(2)tsa对dc2.4细胞成熟的影响:与control组相比,gd组、od组以及ogd组中cd80与cd86的表达有所升高;tsa200nm处理4h后,与各自的模型组相比,dc2.4细胞表面cd80与cd86表达明显上升(p0.05)。(3)tsa对dc2.4细胞抗原摄取功能的影响:与control组相比,gd组、od组以及ogd组中fitc阳性率有所降低;而与各自的模型组相比,tsa处理(同上)后,dc2.4细胞的fitc阳性率显著降低(p0.05)。(4)tsa对dc2.4细胞迁移的影响:与control组相比,gd组,od组以及ogd组迁移距离明显减少;而与各自的模型组相比,tsa处理后,dc2.4细胞的迁移距离显著增加(p0.05)。(5)tsa对dc2.4细胞分泌细胞因子的影响:与各自模型组相比,control、gd以及od组,在tsa处理后il-1β,il-10、il-12和tgf-β四种细胞因子分泌均减少,ogd组在tsa处理后il-1β的分泌减少,il-10、il-12和tgf-β的分泌则增多(p0.05)。(6)tsa对dc2.4细胞中atp产生的影响:与control组相比,gd组与ogd组细胞上清液中atp含量明显减少(p0.05),od组变化较小;与各自的模型组相比较,tsa处理后,细胞上清液中atp含量明显增多(p0.05)。(7)tsa对dc2.4细胞中乳酸产生的影响:与control组相比,gd组、od组以及ogd组细胞上清液中乳酸含量均有所减少,ogd组乳酸含量减少更为显著(p0.05);除control组以外,与各自的模型组相比较,tsa处理后,细胞上清液中乳酸含量均有增多,且gd组与ogd组给药后,细胞上清液中乳酸显著增多(p0.01)。(8)TSA对DC2.4细胞糖酵解相关基因mRNA表达的影响:给予TSA后,HIF-1α、Tpi1、HK2及Ldha的mRNA水平较之相应的模型组显著升高(P0.05)。(9)TSA对DC2.4细胞中PKM2、PKM1和SRSF3蛋白表达的影响:TSA处理后,PKM2与SRSF3蛋白表达较之相应模型组显著升高。而PKM1的表达则显著下调(P0.05)。(10)TSA对DC2.4细胞中PKM2、PKM1、SRSF3 mRNA表达的影响:TSA处理后,PKM2与SRSF3的mRNA表达量较之相应的模型组显著增多,PKM1的mRNA表达量较之相应的模型组显著减少(P0.05)。(11)TSA对干扰SRSF3和PKM2后DC细胞产生ATP和乳酸含量的影响:干扰SRSF3和PKM2后,ATP和乳酸含量均减少(P0.05)。TSA处理后,与Vector组相比,各实验组细胞上清液中ATP和乳酸含量均显著增加(P0.05)。实验结论:(1)TSA能够提高OGD条件下DC2.4细胞的存活率;(2)TSA能够降低OGD条件下DC2.4细胞的抗原摄取能力、促进DC2.4细胞成熟;(3)TSA能够促进OGD条件下DC2.4细胞的迁移、减少IL-1β的分泌、增加IL-10、IL-12和TGF-β的分泌。(4)TSA可能通过上调DC2.4细胞剪接因子SRSF3的表达,促进DC2.4细胞中PKM2的表达,促进糖酵解,增加ATP的产生,从而促进DC2.4细胞存活,并且影响DC2.4细胞的成熟与功能。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R54
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本文编号：
2761945
