实验性房颤心房肌mRNA转录组表达谱分析及IGF1在房颤心房肌纤维化中的作用

发布时间：2020-07-28 08:56

【摘要】：第一部分实验性房颤心房肌mRNA转录组表达谱分析房颤大鼠模型。并于手术前和手术10天后分别行心脏电生理检查,包括AERP和房颤诱发性。研究背景心房颤动(房颤,AF)是最常见的快速性心房电活动紊乱,其发病率高且随着年龄的增长而倍增(85岁时达到7.1%),预计未来25年内房颤患者将增加2倍。心房电活动紊乱导致的血栓栓塞并发症,会给患者造成极高的致残率与致死率,因此房颤严重威胁患者的生命健康,降低患者的生活质量。虽经多年努力,但房颤的治疗效果仍不令人满意,这与其复杂的发生机制仍不为我们熟知相关。经过多年研究,人们认识到心房重构是房颤发生和维持的重要机制,其主要包括电重构、结构重构、自主神经重构。心房重构的分子机制研究及能否寻找到新的分子干预靶点来治疗和预防房颤是人们关注的焦点。执行各种生命活动的生物蛋白分子,源于遗传密码的精确调控。核酸分子的遗传调控远比人类的想象复杂的多,基因组研究和基因表达调控研究为疾病的发生和转归机理开辟了新篇章。研究目的本研究拟探究房颤重构后心房肌mRNA转录组表达谱的变化,确定显著差异表达的基因,并通过生物信息学分析方法筛选在房颤重构通路中发挥重要作用的关键分子,为房颤心房重构发生的分子机制提供新阐释,为房颤的优化治疗提供潜在的靶点。材料与方法1.实验性房颤模型的建立选取20只健康雄性Wistar大鼠,体重在240-260 g,随机分为对照组(n=10)和实验性房颤组(n=10),两组均行手术将小动物起搏电极置于右心房,对照组不予起搏,喂养10天,房颤组以15 Hz(900次/分)起搏10天建立实验性2.电生理指标检测起搏结束后,从右侧颈静脉插入标测电极送入右心房,测定心房有效不应期(AERP)和房颤诱发率。未能成功诱导心房激动的最长S1S2间期为AERP。超速电刺激(20-25 Hz)短阵施放以诱发房颤,房颤的成功诱发定义为快速不规则的心房节律持续l0s。然后,留取心房组织冻存备用。3.转录组的测序分析并验证应用Trizol法提取对照组及房颤组各3只大鼠左心房的总RNAs,通过测序分析检测mRNAs转录本的差异表达。并随机选取部分mRNAs转录本,应用实时定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)的方法,对测序结果进行验证。4.生物信息学分析对存在差异表达的mRNAs行Gene Ontology(GO)富集分析及Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路分析。基于差异表达基因的KEGG分析,将通路中的分子构建树形网络,寻找通路间交叉的关键分子。结果1.通过右心房快速起搏成功建立房颤大鼠模型。与对照组相比,房颤组AERP显著缩短,房颤诱发率增高。2.通过房颤与非房颤大鼠左心房组织的测序分析,同时满足表达量变化(Fold Change)≥2倍且p0.05的mRNA转录本共有956个;其中395个转录本表达下调,561个转录本表达上调。随机选取6个mRNAs转录本行qRT-PCR,其表达趋势与测序结果一致,证实测序结果可靠。3.GO富集分析推测差异表达的mRNAs涉及到细胞增殖、细胞黏附、蛋白质水解等生物学过程;KEGG通路分析表明差异表达的mRNAs与细胞外基质构建、黏附分子通路及肥厚型心肌病等相关的生物学通路密切相关。根据构建的通路分子级联网络,筛选出IGF1、CACNB4、ADCY5、ITGA4等通路交叉点,这些分子可能通过多通路发挥多种生物学关键作用。我们选取IGF1作为房颤重构发生机制研究的关键分子,行进一步探究。结论在房颤/非房颤大鼠左心房内mRNAs转录本存在显著差异性表达,这些差异表达的转录本与房颤心房重构密切相关。第二部分IGF1在心房颤动大鼠心房肌纤维化中的作用研究背景心房颤动(简称房颤)是心房电活动的紊乱,是最常见的快速型心律失常之一,严重影响着患者的身心健康和生活质量。尽管针对房颤的治疗取得了诸多进展,但房颤的治疗效果依然不甚理想,这与其发生机制仍不十分明了有密切关系。结构重构,电重构,自主神经重构在房颤的发生与维持中发挥重要作用。其中结构重构是房颤维持和复发的关键因素。心房结构重构主要表现为显著的心房间质纤维化,且房颤的发生随心房纤维化程度的增加而增加。心房间质纤维化可干扰心房局部的激动传导,造成单向传导减慢或阻滞,增加房颤发生的可能性。彻底治疗房颤是21世纪心血管领域的主战场:是否还有更深入的机制来阐释房颤的发生和维持?是否还有其他干预靶点来预防和治疗房颤?IGF1是一类具有胰岛素样代谢效应的因子,可以促进细胞生长、抑制细胞凋亡;IGF1主要在肝脏合成分泌,骨骼肌、心脏亦可合成肌肉特异性IGF1(mIGF1),通过内分泌、旁分泌等形式调控下游途径;IGF1参与到细胞的增殖、分化、凋亡以及机体代谢、胚胎发育、蛋白沉积与分解等过程中。研究表明,IGF-1作用于相应受体后,其激活的信号途径主要是两条:通过激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)和丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)等信号通路发挥作用。且研究显示,IGF-1是一类强致纤维化因子,能够上调细胞外基质蛋白的表达。研究目的本研究拟探究IGF1因子对房颤大鼠心房肌纤维化的影响,揭示IGF1致纤维化的作用机制和途径,为房颤心房重构发生的分子机制提供新阐释,为房颤的优化治疗提供潜在的靶点。材料与方法1.体外心房成纤维细胞IGF1干扰实验及细胞活力检测体外提取大鼠心房组织成纤维细胞培养,传代至3-4代时行质粒转染实验。将细胞随机分为阴性对照组,mIGF1过表达组,mIGF1沉默组。培养48 h后提取RNA,72 h后提取蛋白。并应用CCK8试剂盒检测质粒转染后的细胞活力。2.在体感染AAV9型腺相关病毒体外构建AAV9型mIGF1沉默腺相关病毒。选取30只健康雄性Wistar大鼠,体重在240-260 g,随机分为阴性对照组(n= 10),植入起搏对照装置,尾静脉注射阴性对照腺相关病毒;起搏组(n=10),行右心房快速起搏(15 Hz),尾静脉注射阴性对照腺相关病毒;起搏+mIGF1沉默病毒组(n=10),行右心房快速起搏(15 Hz),尾静脉注射mIGF1沉默干扰腺相关病毒。起搏电极植入方法同第一部分。手术后通过尾静脉注射1 × 10E11 TU的腺相关病毒。于起搏10天后停止起搏。病毒注射14天后处死动物,取心房组织冻存行下一步实验。3.AERP的检测及房颤诱发手术前及动物处死前,应用多通道程序刺激仪分别对阴性对照组、起搏组、起搏+mIGF1沉默病毒组行电生理检查,测定AERP和房颤诱发性。4.分子生物学指标的检测Trizol法提取感染后组织和转染后细胞的总RNAs,qRT-PCR方法检测IGF1、CTGF、AT1R、COL1A1、COL3A1 的表达量;应用 Western Blotting 方法测定IGF1、CTGF、AT1R、p/t-PI3K、p/t-Akt、Bcl2、Bax等基因蛋白的表达水平。5.免疫组化及Masson染色对CTGF、TGF-β1等指标行免疫组化染色,测定阳性指标表达量;对组织切片行Masson染色,鉴定纤维化程度。结果1.对于心房成纤维细胞行mIGF1基因表达干扰,与阴性对照组比较,mIGF1过表达后,CTGF、AT1R基因的表达上调,PI3K和Akt蛋白的磷酸化水平上调,Bc12/Bax的比值增加,细胞活力升高,COL1A1、COL3A1表达量上调;反之,mIGF1低表达后,CTGF、AT1R基因的表达下调,PI3K和Akt蛋白的磷酸化水平下调,Bc12/Bax的比值降低,细胞活力减弱,COL1A1、COL3A1表达量下调。2.相对于阴性对照组,起搏组AERP显著降低,房颤诱发率升高;而相对于起搏组,起搏+mIGF1沉默病毒组AERP增高,但仍低于阴性对照组,房颤诱发率有所改善。3.免疫组化与Masson染色结果显示,与阴性对照组比较,起搏组心房组织mIGF1表达量上调,TGF-β1、CTGF 阳性指标含量增加,纤维化程度加重;而与起搏组比较,起搏+mIGF1沉默病毒组心房组织mIGF1表达量下调,TGF-β1、CTGF阳性指标含量降低,纤维化程度减弱。结论1.我们发现mIGF1与房颤结构重构密切相关,且通过功能沉默实验明确了mIGF1在房颤心房肌纤维化中的作用;2.mIGF1通过激活PI3K-Akt通路上调CTGF、AT1R的表达发挥致纤维化作用。创新性1.通过测序分析,明确了房颤重构相关的转录本表达谱变化。2.探索mIGF1调控房颤心房肌纤维化的分子机制,有助于房颤发生与维持机制的研究,有望为房颤的防治提供潜在的干预靶点;3.借助于腺相关病毒介导的体内基因表达调控技术,研究mIGF1对房颤心房结构重构的影响及机制。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R541.75

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