【摘要】：第一部分腹主动脉瘤动物模型的建立及超声圆周应变量的应用价值研究目的应用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)微泵灌注方法建立小鼠腹主动脉瘤(AAA)模型,通过超声对整个病理过程进行监测,探讨模型可行性以及相关特点,并评价超声圆周应变量的应用价值。研究方法采用APOE~(-/-)雄性小鼠25只,给予微泵皮下植入方式建立灌注模型,其中5只为生理盐水灌注即对照组(Con组),20只为AngⅡ灌注组(AngⅡ组)。所有小鼠于术前1天(D0),术后3天(D3),术后1周(D7),术后2周(D14)及术后4周(D28)进行超声监测;D28时按正常小鼠动脉150%为成瘤标准,将AngⅡ组分为成瘤(AngⅡ+AAA)及未成瘤(AngⅡ+NoAAA)组。除应用B-mode(brightness mode)测量主动脉直径和形态外,并在M-mode(motion mode)下测量收缩及舒张期动脉直径(D_S,D_D)以计算圆周应变量,应用血管斑点示踪技术观察血管弹性运动轨迹,对比各组小鼠腹主动脉直径变化,成瘤时间和部位等,计算成瘤率、死亡率及圆周应变量等;在微泵植入术后4周进行主动脉取材进行切片分析。研究结果研究终点时Con组的存活率100%,成瘤率为0%;AngⅡ组成活率80%,成瘤率62.5%,并且腹主动脉最大直径均值显著高于Con组。AngⅡ组主动脉直径呈现增大趋势,在D7时最大直径较前显著增大,同时D28与D14相比血管最大直径显著增大,但成瘤率不变;圆周应变量呈逐渐下降趋势,D3与D0相比下降明显,但成瘤率为0%,并在D14时与Con组相比明显下降。D28时按成瘤标准分组可以发现AngⅡ+AAA组圆周应变量呈下降趋势并在D3出现明显下降,且与其它两组差异明显,而Con组及AngⅡ+NoAAA组整个过程中圆周应变量改变不明显。血管斑点示踪同样发现在D3时AngⅡ+AAA小鼠尽管血管形态及直径无明显改变,但随着心动周期的血管弹性明显下降。大体标本可见AngⅡ+AAA组腹主动脉肾动脉上段明显扩张,而Con组与AngⅡ+NoAAA组血管大体正常,无明显扩张。动脉切片HE染色:AngⅡ+AAA组与其它两组相比小鼠腹主动脉壁明显增厚,中膜弹力纤维层中断甚至部分消失,部分组织结构分辨不清。研究结论应用AngⅡ微泵灌注建立小鼠AAA模型操作简单,成瘤率稳定,但仍存在一定的死亡率,是种相对理想的AAA动物模型,超声监测操作方便,能实时动态监测动脉瘤的发生、发展,具备良好的应用价值,同时圆周应变量这一生物力学指标可能在预测动脉瘤发生、发展中具备良好的应用价值。第二部分骨髓间充质干细胞在主动脉瘤组织修复中的作用及机制研究研究目的应用超声筛选出已明确成瘤的小鼠,通过BM-MSCs经尾静脉注射干预,来观察BM-MSCs能否到达血管损伤处参与AAA的修复过程,以及具体的作用方式和相关机制。研究方法总28只APOE-/-雄性小鼠,5只给予生理盐水微泵植入(Con组),另23只植入Ang Ⅱ微泵。术后2周行超声检查,按照正常直径×150%为标准筛选出成瘤小鼠;共12只小鼠符合成瘤标准,随机分成Ang Ⅱ+Msc组与Ang Ⅱ组,两组瘤体最大直径及圆周应变量无差异;Ang Ⅱ组给予生理盐水经尾静脉注射,Ang Ⅱ+Msc组给予自带荧光标记BM-MSCs尾静脉注射,植入术后4周行第2次注射,6周后行超声检查并处死小鼠收集标本,应用免疫荧光、ELISA、Western Blotting等方法检测三组之间是否存在差异。研究结果终点时Ang Ⅱ组与Ang Ⅱ+Msc组间瘤体最大直径无明显差异;但Ang Ⅱ组瘤体直径6周与2周相比明显增大,而Ang Ⅱ+Msc组前后相比无明显差异,同时两组间与组内的圆周应变量均无明显差异。通过荧光标记观察到MSCs具备向血管损伤处聚集的特性,并主要分布在内中膜,外膜未查及;CD68+染色可见MSCs能减少巨噬细胞对血管壁的侵润,而Ang Ⅱ+Msc组血管壁细胞凋亡率要明显好于Ang Ⅱ组;HE染色和EVG染色可见Con组血管管腔正常,中膜弹力纤维层完好,Ang Ⅱ组与Ang Ⅱ+Msc组中膜弹力纤维层均有不同程度的破坏但Ang Ⅱ+Msc组在血管腔面有较完整连续细胞排列结构,中膜仍可见较多弹力蛋白染色阳性纤维呈层状排列,而Ang Ⅱ组存在明显附壁血栓形成;CD31染色可见MSCs具备向内皮样细胞分化的能力,同时Ang Ⅱ+Msc组在血管腔面存在连续排列的CD31+细胞;应用α-SMA/OPN免疫组化染色可见Con组弹力纤维层中VSMC以α-SMA染色为主,OPN几乎无表达,Ang Ⅱ+Msc组VSMC仍以梭形形态为主,α-SMA+染色较多,但Ang Ⅱ组VSMC以圆形或三角形形态为主,OPN+染色较多;同时弹力纤维层结构已消失的中膜,Ang Ⅱ+Msc组仍可见层状排列纤维存在,纤维间部分细胞呈梭形形态,并呈α-SMA+染色,而Ang Ⅱ组很少类似纤维存在,细胞形态大多为圆形或三角形,α-SMA+细胞很少;免疫荧光检测可见MSCs能表达胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、血管内皮生长因子(VEGF)及血小板衍生因子-B(PDGF-B);ELISA检测相关炎症因子可以发现MSCs干预能减少动脉瘤组织中IL-6,MCP-1及TNF-α的含量;最后Western Blotting检测提示Ang Ⅱ+Msc组相对Ang Ⅱ组的MMP-2、MMP-9表达更少,同时Ang Ⅱ组与Ang Ⅱ+Msc组的α-SMA的表达水平下降,尽管Ang Ⅱ+Msc组高于Ang Ⅱ组,但差异并不明显,而OPN在Con组几乎不表达,Ang Ⅱ+Msc组的OPN表达水平明显低于Ang Ⅱ组。研究结论MSCs对于已成瘤的AAA发展同样起到抑制作用,这种作用除了能减轻血管壁的炎症细胞侵润、抑制相关炎症因子和MMPs的活性、减少VSMC的凋亡、分泌相关生长因子等外,还能通过在促进血管内皮细胞层的修复,减少附壁血栓的发生,并调控VSMC过度去分化,进而维持VSMC的功能与数量的平衡等方面起到重要的作用,通过上述作用共同达到抑制AAA的进一步发展的作用。第三部分骨髓间充质干细胞调控平滑肌细胞表型的验证及可能机制研究目的通过细胞共培养的方式,验证MSCs对VSMC的凋亡和表型的调控作用,并探讨Notch通道在表型调控中的作用。研究方法应用单独VSMC培养、MSCs与VSMC直接混合及Transwell间接混合培养,计为VSMC、VSMC-MSC、Tra-VSMC-MSC组,通过免疫荧光和Western Blotting等方法来进行相关检测,比较组间的差异。研究结果VSMC-MSC组中的α-SMA+VSMC细胞占比多于VSMC组,组间差异明显;VSMC组中的OPN+VSMC细胞占比多于VSMC-MSC组且组间差异明显;Tra-VSMC-MSC组与VSMC组组间无明显差异。200um的H_2O_2刺激24小时后VSMC-MSC组中VSMC的凋亡率低于VSMC组;Tra-VMSC-MSC组凋亡率低于VSMC组;而VSMC-MSC组与Tra-VMSC-MSC组组间无差异。VSMC-MSC组的NICD+VSMC占比高于VSMC组。同等数量的VSMC和MSC行Western Blotting检测:MSCs相对VSMC能够表达更多的Jagged-1。研究结论MSCs除了可以抑制VSMC凋亡外,还可以通过直接接触来调控VSMC的表型转化,并且Jagged-1-Notch通道可能在其中起到重要作用,这个可能是MSCs抑制AAA发生、发展的机制之一;病理过程中VSMC的增殖、表型以及功能改变,是一个复杂的过程,三者之间互有联系,又存在区别,而维持VSMC结构和功能的平衡可能显得意义更为重大;Notch通道的激活在AAA中作用可能是把双刃剑,其可能在加重炎症反应方面促进AAA的发生,而在调控VSMC的表型、抗凋亡、维持VSMC的数量和功能平衡等方面可能起到抑制AAA的作用,而这些作用可能与整个血管壁的微环境有关。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R543.16
【图文】：
骨髓间充质干细胞在腹主动脉瘤组织修复中的作用及机制研究主动脉瘤成瘤率为 0%，腹主动脉直径(1.072±0.119mm);AngII 组小鼠 20 只，最终成活率 80%，腹主动脉瘤成瘤率 62.5%，腹主动脉直径（1.682±0.620mm)，在 D28 时候AngII 组显著高于 Con 组（1.682±0.620mm vs 1.072±0.119mm P=0.037）。
Con组小鼠主动脉纵切面测量图像
Con组小鼠主动脉横切面测量图像
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本文编号：
2780693
