LKB1通过Hippo-Yap信号在心肌细胞增殖中的作用研究与鸢尾素对心肌梗死的保护作用研究

发布时间：2020-08-08 16:56

【摘要】：LKB1通过Hippo-Yap信号在心肌细胞增殖中的作用研究研究背景:在全世界范围内,随着社会的发展和人们生活水平的提高,心肌梗死的发病率和死亡率不断上升。心肌梗死的发生通常是指冠状动脉的血流急剧减少或者中断而导致的心肌缺血性坏死。心梗发生之后,大量心肌细胞死亡,纤维瘢痕形成,心功能明显受损。传统观点认为心脏是一种终末分化器官,成年哺乳动物心肌细胞退出细胞周期循环,失去了增殖的能力。近年来的研究发现,心脏是不断更新的器官,人类心肌细胞的更新率随年龄的增大而逐渐降低,在20岁时心肌细胞的年更新率为1%,到75岁时降至0.3%。但是心肌细胞这种微弱的增殖能力并不足以弥补心肌梗死后死亡的细胞。研究表明,以小鼠为例,小鼠的心肌细胞在出生后一周以内增殖能力明显下降,到出生后三周,增殖能力在正常情况下几乎完全消失。如何更大程度地促进心肌细胞增殖用以补充死亡的心肌细胞是现阶段心肌再生研究的重点。肝脏激酶B1(LKB1)作为一种丝/苏氨酸激酶被广泛研究,它在细胞极性、细胞增殖和肿瘤抑制中发挥着重要的作用。我们发现LKB1的表达与小鼠出生后心肌细胞增殖能力密切相关。出生后第一天LKB1表达量较低,随着心肌细胞增殖能力的降低,LKB1表达量逐渐升高。因此,我们推测当抑制LKB1的表达时,心肌细胞的增殖能力提高。而我们的前期研究刚好证明了,在心肌细胞中,当LKB1表达降低时,心肌细胞增殖能力增强。但是LKB1如何参与并调控心肌细胞的增殖,目前尚不十分清楚。研究显示,Hippo-YAP信号通路是参与心肌细胞增殖的关键信号,YAP作为转录因子参与细胞周期的调控。细胞周期的调控是一个涉及多种信号的分子的复杂过程,然而,YAP是否参与LKB1降低对心肌细胞增殖的调控,目前尚无相关报道。因此,本研究提出LKB1降低通过YAP信号调控心肌细胞增殖的假设,通过体外建立LKB1 siRNA处理模型和成年小鼠心梗的AAV9感染模型,检测LKB1降低时对心肌细胞增殖能力的影响,并通过对YAP和Cyclin D的检测和调控,明确LKB1降低调控心肌细胞增殖的作用机制。研究方法:1.以C57/BL6小鼠为研究对象,通过提取小鼠不同时间点(出生后1,7,28天)的心脏RNA,比较心脏中LKB1的表达。明确随着时间的推移心肌细胞增殖能力的降低,心脏中LKB1的表达变化。2.以新生乳鼠的心肌细胞为研究对象,通过LKB1 siRNA干扰处理,观察心肌细胞中LKB1表达降低,心肌细胞增殖能力的变化。通过免疫荧光染色的方法,以心肌细胞核中Ki67,pH3为衡量指标,计算心肌细胞的Ki67,pH3的阳性率,比较LKB1降低之后Ki67,pH3阳性率的变化。明确LKB1降低对心肌细胞增殖具有调控作用。3.以C57/BL6小鼠为研究对象,通过结扎小鼠心脏左前降支血管建立小鼠心梗模型,通过AAV9-LKB1-GFP-shRNA病毒心包注射到小鼠心脏,观察小鼠心脏中心肌细胞Edu的阳性率,明确LKB1降低能够促进成年小鼠心肌细胞的增殖。4.通过WB实验检查在LKB1降低的条件下心肌细胞中YAP和Cyclin D的变化情况。明确在LKB1降低的条件下,YAP对心肌细胞增殖具有调控作用。结果:1.随着小鼠出生之后心肌细胞增殖能力的下降,心脏中LKB1的表达增加:通过提取心脏组织中的总RNA,比较不同时间点(出生后1天,7天,28天)心脏中LKB1的表达发现在小鼠心肌细胞增殖能力最强的时候(出生后1天),心肌细胞中LKB1的表达最低,出生后7天,28天心脏中LKB1的表达均明显高于出生后1天。2.通过LKB1 siRNA干扰的方法降低心肌细胞中LKB1的表达,发现心肌细胞的增殖指标Ki67,pH3均明显升高:提取新生乳鼠心肌细胞之后使用LKB1 siRNA处理之后,通过免疫荧光的方式比较心肌细胞核中Ki67,pH3的表达,发现LKB1表达降低可以促进心肌细胞增殖。3.构建AAV9-LKB1-GFP-shRNA病毒载体,建立成年小鼠心梗模型,发现在小鼠心梗之后注射病毒可以提高心肌细胞增殖能力:在小鼠心梗模型建立之后,心包注射病毒,两周之后检查Edu的心肌细胞阳性率,发现心肌细胞增殖增加。4.WB结果显示,LKB1 siRNA处理显著提高心肌细胞中YAP和Cyclin D的表达,同时降低YAP的磷酸化活性。提示我们在LKB1表达降低时,YAP参与了心肌细胞增殖的调控。结论:LKB1降低后,心肌细胞YAP活性升高,通过下调YAP的磷酸化水平,引起细胞周期相关蛋白Cyclin D表达升高,最后心肌细胞增殖能力增加。该结论进一步丰富了我们对心肌细胞增殖能力调控的理论知识,为心梗病人的心肌细胞损害的治疗提供了新的靶点。鸢尾素对心肌梗死的保护作用研究研究背景:在全世界范围内,心肌梗死的发病率和死亡率日益增高。冠状动脉的血流急剧减少或者中断而导致的心肌缺血性坏死会造成大量心肌细胞死亡,纤维瘢痕生成,心功能明显受损。而鸢尾素作为一种在运动过程中由骨骼肌分泌的一种蛋白,对多种器官的损伤具有保护作用。在我们之前的研究中发展鸢尾素对心肌的缺血再灌注损伤具有明显的保护作用,我们猜想,鸢尾素可能同样会对心肌梗死有保护作用。研究方法:1.首先为了明确鸢尾素对心肌梗死的作用,我们建立了小鼠的心肌梗死模型,外源性给予鸢尾素(5ug/g/d),腹腔注射给药连续两周,分别在心肌梗死后7天,14天,28天的时候观察小鼠的心功能,同时在心梗后28天检测心肌的纤维化程度。2.然后为了观察鸢尾素对心肌细胞凋亡和血管新生的影响,我们利用Tunel染色的方法比较心肌梗死2天后心肌细胞凋亡的数目,同时用免疫荧光染色观察心梗后14天梗死区域血管新生的情况。3.最后为了明确鸢尾素对血管新生的影响,我们以人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为研究对象,分别用鸢尾素和U0126处理,通过Westernblot观察其对ERK的影响变化,同时通过细胞体外迁移能力测定观察HUVEC的迁移情况。研究结果:1.在心肌梗死之后,外源性给予鸢尾素处理之后,在心梗后7天,14天,28天对小鼠心功能检测发现,鸢尾素处理之后在心梗后28天小鼠心功能明显提高,同时在心梗后28天发现小鼠的心肌纤维化程度降低。2.在心梗后两天Tunel染色发现,鸢尾素给药的小鼠,心肌细胞Tunel染色阳性明显降低,提示心肌细胞凋亡减少,同时通过CD31免疫荧光染色发现,心梗后14天,鸢尾素给药小鼠,心肌梗死边缘区CD31表达增加,提示有新生血管形成。3.Westernblot的结果提示我们鸢尾素可以促进ERK的磷酸化但是这种促进作用可以被U0126阻断。同时细胞迁移能力测定提示我们鸢尾素处理之后,内皮细胞迁移明显增加,而在同时应用U0126之后,可以减少内皮细胞的迁移。结论:鸢尾素通过减少心肌细胞凋亡,减轻心肌纤维化程度以及促进血管新生对心肌梗死发挥治疗作用,并且鸢尾素促进新生血管的形成是通过ERK信号介导的。
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R542.22
【图文】：

心肌细胞增殖,干扰效率,心肌细胞,阳性率

陆军军医大学硕士学位论文3.2 在新生乳鼠心肌细胞当中，LKB1 表达降低促进心肌细胞增殖。原代培养的大鼠心肌细胞随机分为两组，一组为对照组（+scramble siRNA 组），一组为实验组（+LKB1 siRNA 组），干扰处理 48 小时之后，提取细胞 RNA，通过荧光定量 PCR 检测发现实验组中 LKB1 的表达明显降低(图 3-2 A)。进一步研究发现，新生乳鼠心肌细胞中 LKB1 表达降低之后，免疫荧光染色提示心肌细胞 Ki67(图 3-2B)(标尺=50μm), pH3(图 3-2C)(标尺=50μm)的阳性率明显增加（n=5; *P<0.05）。

统计图,心肌细胞增殖,病毒,肌细胞

图 3-3：AAV9-LKB1-GFP-shRNA 病毒促进成年小鼠心肌细胞增殖A：AAV9-LKB1-GFP-shRNA 病毒的对 LKB1 表达的影响, p＜0.05，n=3;B：AAV9-LKB1-GFP-shRNA 病毒对心肌细胞的感染，GFP 代表 AAV9 病毒，红色代表 cTnT心肌细胞；C：MI 后用 AAV9-LKB1-GFP-shRNA 病毒处理对心肌细胞 Edu 阳性率的影响，B1 为免疫荧光图片，B2 为统计图，箭头表示 Edu 阳性的心肌细胞。3.4. LKB1 降低促进 YAP 介导的 Cyclin D 的表达原代培养的大鼠心肌细胞随机分为两组，其中一组为对照组（scramble siRNA 组），另一组为实验组（LKB1 siRNA 组）。干扰处理 48 小时后，分别提取总蛋白，WB 检测发现实验组中 YAP 表达明显升高，同时 YAP 的磷酸化减少（图 3-4 A），而细胞周期蛋白 Cyclin D 表达上升（图 3-4 B）。（n=6; *P<0.05）。

肌细胞,磷酸化

26图 3-4：LKB1 表达降低对心肌细胞 YAP 和 Cyclin D 的影响A: WB 结果表示 LKB1 siRNA 处理之后，YAP(A2)和 YAP 磷酸化(A3)的变化，n=6; P<0.05B: WB 结果表示 LKB1 siRNA 处理之后，Cyclin D 的变化，n=6; P<0.05

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