常、低氧条件培养对人血管内皮祖细胞干性的影响

发布时间：2020-08-08 22:47

【摘要】：目的:血管内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)在体内位于骨髓的低氧微环境中,然而目前所广泛采用的EPCs扩增方法都是非生理环境的空气(常氧,～20%02)中,实验拟比较骨髓微环境更为相似的低氧条件(1%02)与常氧(～20%02)两种条件对体外扩增人骨髓来源的EPCs干性的影响,并通过高通量测序的方法初步探究其内在的机制,为改进EPCs的体外扩增方法提供更充分的理论依据。方法:1.从人骨髓中分离出EPCs,分别在常氧(20%02)和低氧条件(1%02)下培养,通过细胞计数计算群体倍增时间来确定EPCs的体外扩增能力;通过细胞衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测EPCs细胞衰老;以及以qRT-PCR检测衰老相关细胞周期调节蛋白P16的表达;2.采用克隆形成实验观察常氧和低氧两组的原代和第5代EPCs的克隆形成能力;通过体外成血管实验观察两组的EPCs成血管能力;以Transwell迁移实验观察其迁移的能力;3.以全转录组RNA高通量测序(RNA-seq)筛选常氧和低氧条件培养的EPCs的差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs),并对这些DEGs进行生物信息学分析,包括GO功能富集分析和KEGG pathway分析,以Western blotting检测代表性蛋白从而做进一步验证。结果:1.与1%O_2低氧培养条件相比,常氧条件培养的EPCs生长速率较慢,群体倍增时间明显增加(P0.05),衰老相关β-半乳糖苷酶染色中衰老细胞的比例明显增加(P0.05),衰老相关细胞周期调节蛋白P16表达明显增加(P0.01)。2.与1%02低氧条件相比,常氧条件下体外扩增的原代(P0.01)和第5代(P0.01)EPCs克隆形成能力均显著下降;常氧条件下细胞的体外成管状结构的长度明显降低(P0.05),Transwell迁移实验证实迁移的细胞数量明显减少(P0.05)。3.RNA-seq总共筛选出48个DEGs,GO和KEGG生物信息学分析显示代谢相关通路:细胞对脂肪酸的反应、酮体的合成和降解;细胞增殖相关通路:涉及有丝分裂细胞周期的泛素蛋白连接酶的调节、p53信号通路等显著富集。Western blotting检测了DEGs中增殖相关的蛋白,包括p53、IGFBP3、CCNB1和GDF15。WB结果显示与1%02低氧组相比,常氧条件扩增的EPCs中p53(P0.05)和GDF15(P0.05)表达显著上调,两组间IGFBP3和CCNB1的表达无统计学差异。结论:1%O_2低氧条件相对于目前广泛采用的常氧条件更有利于人骨髓来源的EPCs的体外扩增,减少细胞衰老,增强EPCs的克隆形成能力、体外成血管能力和迁移能力,因此有利于干细胞干性的保持。包括p53信号通路在内的多种信号通路与低氧维持EPCs干细胞干性相关。本研究有助于改进目前所广泛采用的传统的EPCs扩增方法,提高EPCs的体外扩增效率。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R54
【图文】：

接下来我们比较了在常氧条件下和１％0２低氧条件下原代和第５代ＥＰＣｓ的逡逑集落形成能力。将原代和第５代ＥＰＣｓ分别在常氧或低氧（１％０２）条件下培养逡逑约８天后计数大于５０个细胞的克隆的数目。如图２－２Ａ和图２－２Ｂ所示，相比于逡逑１％0２低氧条件，常氧条件下原代ＥＰＣｓ的集落形成能力显著降低＜０．０１），逡逑差异有统计学意义；如图２－２Ｃ和图２－２Ｄ所示，相比于１％０２低氧条件，常氧逡逑条件下第５代ＥＰＣｓ的集落形成能力也显著降低（Ｐ＜０．０１邋）。逡逑１８逡逑

石页士学位论文ｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇＯｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ａｌｌ／ＧＣＦ／０００／００１／４０５／ＧＣＦ＿０００００１４０５．２６的表达定量分析由ｓｔｒｉｎｇｔｉｅ软件完成，基因表达的计算方法为：邋ｎｕｍｂｅｒ邋ｏｆ邋Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ邋Ｐｅｒ邋Ｋｉｌｏｂａｓｅ邋ｏｆ邋ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ｐｅｒ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ），即每百万ｆｒａｇｍｅｎｔｓ中来自某一基因每千碱基Ｈ。在基因定量结果的基础上，米用Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ软件ｃｕｆｆｄｉｆｆ分析。差异结果的筛选标准为｜ｌ0ｇ２Ｒａｔｉｏｇｌ且ｑｖａｌｕｅ＾Ｏ．０５。逡逑达水平散点图分布见下图．？逡逑邋逦逡逑

３．３．２对差异衣达基因进行ＫＥＧＧ邋ｐａｔｈｗａｙ功能分析逡逑对差异表达基因进行ＫＥＧＧ邋ｐａｔｈｗａｙ分析有助于／解ＤＥＧｓ的生物学功能。逡逑ＫＥＧＧ分析结果显示富集了邋６条通路（表３－８，

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本文编号：2786217