TIM-3在骨髓增生异常综合征发病机制中作用的研究

发布时间：2020-08-13 12:59

【摘要】：目的前期工作已证实,骨髓增生异常综合征(MDS)患者的骨髓造血干细胞上高表达TIM-3,TIM3+干细胞具有高增殖、低分化、低凋亡的特点。本研究从细胞形态学、细胞遗传学及动物模型等方面进一步探讨TIM3+干细胞的恶性生物学特征,为早期识别MDS恶性克隆提供理论依据。方法研究对象为天津医科大学总医院自2016年7月至2018年2月收治的新诊断的MDS患者44例及正常对照者17例。第一部分采用流式细胞术分选10例MDS初治患者骨髓中TIM3+干细胞(TIM3+CD34+CD38-Lin-细胞群)和TIM3-干细胞(TIM3-CD34+CD38-Lin-细胞群)及4例正常对照者骨髓中CD34+干细胞(CD34+CD38-Lin-细胞群),分别进行瑞氏染色、集落形成单位培养和荧光原位杂交技术(FISH)检测,了解TIM3+干细胞的生物学特性。第二部分流式检测15例MDS患者及8例正常对照骨髓中髓源性抑制细胞(MDSC,CD33+Lin-HLADR-细胞群)上Gal-9的表达情况。流式分选8例MDS初治患者骨髓TIM3+干细胞、TIM3-干细胞和MDSC,分别加入TIM-3抑制剂和Gal-9抑制剂体外混合分组培养,检测TIM3+干细胞和TIM3-干细胞的凋亡情况,分析TIM-3/Gal-9通路在MDS患者TIM3+干细胞与MDSC间的作用。第三部分流式分选11例MDS初治患者骨髓的TIM3+干细胞、TIM3-干细胞和MDSC和5例正常对照者骨髓中CD34+干细胞,移植到32只NCG小鼠体内,10-12周后采集小鼠外周血和骨髓,流式检测人源性细胞分化情况,探索TIM3+干细胞在MDS的发病过程中作用。结果第一部分分选后的TIM3+干细胞和TIM3-干细胞的纯度均在90%以上。MDS患者TIM3+干细胞和TIM3-干细胞甩片后瑞氏染色高倍镜下观察细胞均呈圆形或椭圆形、细胞体积较小、胞核大、核仁明显、核染色质细致、胞浆呈浅蓝色不带颗粒、高核浆比,在形态上呈现为原始幼稚细胞样。集落形成单位(CFU)检测,观察到TIM3+干细胞、TIM3-干细胞和正常骨髓CD34+干细胞形成BFU-E数量平均值为(6 vs 11 vs 12)个、CFU-E数量平均值为(3 vs 6 vs 9)个、CFU-GM数量平均值为(5 vs 17 vs 23)个。同时观察到TIM3+干细胞形成的单个集落所包含的细胞数量也较TIM3-干细胞和正常骨髓CD34+干细胞少,且TIM3+干细胞部分细胞未形成集落。FISH检测染色体核型异常(-7)在一例MDS患者的TIM3+干细胞比例要高于TIM3-干细胞及常规骨髓细胞(30%vs20%vs 16%);异常核型(+8)在另一例MDS患者的TIM3+干细胞检测到的比例高于常规骨髓细胞,而在TIM3-干细胞中未能检出(5%vs 3%vs 0);异常核型(20q-)在TIM3+干细胞中可以检测出,常规骨髓细胞和TIM3-干细胞中均未检测出该异常核型(26.7%vs 0 vs 0);在正常对照者骨髓CD34+干细胞中均未检测到异常核型。第二部分我们前期工作已发现MDS患者骨髓MDSC数量增多、功能增强,并随着疾病危险程度增加和疾病进展而上升。MDS组的骨髓MDSC上Gal-9表达率明显高于正常对照组(0.62±0.64%vs 0.22±0.18%,P0.05)。经流式分选后的MDS患者骨髓中MDSC的纯度在90%以上。未使用抑制剂的TIM3+干细胞和MDSC混合培养组TIM3+干细胞凋亡比例明显低于联合使用Gal-9和TIM-3两种抑制剂组及TIM3-干细胞和MDSC混合培养组[12.59(5.12,31.24)vs 42.54(29.41,58.39),65.86(24.44,99.43),P0.05]。第三部分移植TIM3+干细胞和MDSC混合组hCD45表达率明显高于TIM3+干细胞组、TIM3-干细胞组及正常对照CD34+干细胞组(4.99±5.47%vs 0.65±0.22%,1.68±2.38%,0.55±0.40%,P0.05)。移植TIM3+干细胞组hCD19表达率明显低于TIM3-干细胞组和正常对照CD34+干细胞组(8.68±9.34%vs27.46±18.06%,37.38±16.14%,P0.01);移植TIM3+干细胞和MDSC混合组hCD19表达率明显低于TIM3-干细胞组及正常对照CD34+干细胞组(4.76±4.78%vs 27.46±18.06%,37.38±16.14%,P0.05)。移植TIM3+干细胞组hCD33表达率明显低于TIM3-干细胞组(11.34±14.70%vs 22.45±8.73%,P0.05),低于正常对照CD34+干细胞组(18.03±10.05)%,差异无统计学意义;移植TIM3+干细胞和MDSC混合组hCD33表达率明显低于TIM3-干细胞组(5.07±5.29%vs 22.45±8.73%,P0.05),低于正常对照CD34+干细胞组,差异无统计学意义。移植TIM3+干细胞组、TIM3-干细胞组、TIM3+干细胞和MDSC混合组及正常对照CD34+干细胞组hCD13表达率分别为(18.50±22.54)%、(6.11±5.26)%、(1.13±0.62)%及(14.33±0.69)%,各组间差异无统计学意义(F=1.101,P=0.367)。移植TIM3+干细胞组、TIM3-干细胞组、TIM3+干细胞和MDSC混合细胞组hCD11b表达率分别为(1.02±1.44)%、(10.19±6.30)%和(8.07±3.70)%。结论(1)MDS患者的TIM3+干细胞与TIM3-干细胞从形态学上很难区分,但两者集落形成能力有明显区别,TIM3+干细胞中更早和更易发现染色体核型异常,故为不同类型的干细胞,TIM3+干细胞可能为较早发生核型异常的“恶性”干细胞。(2)MDS患者骨髓MDSC细胞膜上Gal-9的表达明显增高。TIM3+干细胞和MDSC混合培养组TIM3+干细胞凋亡比例明显低于TIM3-干细胞和MDSC混合培养组TIM3-干细胞凋亡比例,阻断TIM-3/Gal-9通路组TIM3+干细胞凋亡比例增高。阻断TIM-3/Gal-9通路可以抑制MDSC对TIM3+干细胞抗凋亡作用,为清除MDS患者恶性克隆提供新的试验靶点。(3)TIM3+干细胞和MDSC混合移植到NCG小鼠后,可检测到人源性细胞数量最多,在小鼠模型中MDSC可以促进TIM3+干细胞扩增。移植TIM3+干细胞组和TIM3+干细胞与MDSC混合组的人源性细胞,不能像移植TIM3-干细胞或正常对照CD34+干细胞一样进行正常的分化。推测TIM3+干细胞具有克隆性生长可能,而MDSC对其有促进作用。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R551.3
【图文】：

干细胞,瑞氏染色,骨髓

天津医科大学博士学位论文一、MDS 患者 TIM3+干细胞生物学特性的研究1.2.2 瑞氏染色显微镜下形态将分选出 MDS 患者（Pt1、Pt2）TIM3+干细胞和 TIM3-干细胞分别甩片后进行瑞氏染色，高倍镜下观察细胞形态。镜下可见两种细胞均呈圆形或椭圆形细胞体积较小，胞核大，核仁明显，核染色质细致，胞浆呈浅蓝色不带颗粒，高核浆比，在形态上呈现为原始幼稚细胞样（图 1.3）。因此很难用形态学识别TIM3+干细胞和 TIM3-干细胞。A B

干细胞,骨髓,培养皿,集落计数

医科大学博士学位论文一、MDS 患者 TIM3+干细胞生物学特性的研F G1.4 （A）Pt4 骨髓 TIM3+干细胞集落培养培养皿情况，培养皿中罕有红色；（B）Pt4 骨髓 TIM3+干细胞部分细胞未形成集落；（C）Pt4 骨髓 TIM3+ BFU-E（100×）；（D）Pt4 骨髓 TIM3+干细胞 CFU-GM（100×）；（E 骨髓 TIM3- 干细胞集落培养培养皿情况，培养皿可见散布红色集落；（F 骨髓 TIM3- 干细胞 BFU-E（100×）；（G）Pt4 骨髓 TIM3- 干细胞 CFU-G（100×）。

骨髓,干细胞,培养皿,集落

图 1.4 （A）Pt4 骨髓 TIM3+干细胞集落培养培养皿情落；（B）Pt4 骨髓 TIM3+干细胞部分细胞未形成集落细胞 BFU-E（100×）；（D）Pt4 骨髓 TIM3+干细胞 CPt4 骨髓 TIM3- 干细胞集落培养培养皿情况，培养皿可Pt4 骨髓 TIM3- 干细胞 BFU-E（100×）；（G）Pt4 骨髓（100×）。

【参考文献】