APN修饰的BMSCs移植改善糖尿病大鼠心肌纤维化的实验研究

发布时间：2020-08-13 15:01

【摘要】：目的:本研究旨在构建携带脂联素(APN)基因的慢病毒,并转染分离培养的骨髓间充质干细胞(Bone marrow stem cells,BMSCs)体系,同时建立糖尿病大鼠模型,通过尾静脉输注移植APN基因修饰的BMSCs,研究APN基因修饰的BMSCs(BMSCs+APN)在改善糖尿病心肌病大鼠心肌损伤与修复中的作用及其潜在机制,也为临床上治疗糖尿病心脏病的并发症提供新的治疗靶点和实验依据。方法:第一部分:从含有目的基因APN的质粒克隆模板中,利用PCR技术获取目的基因片段,将目的基因载体LV5进行双酶切。将纯化的PCR产物与线性化的载体连接,重组产物转化感受态细胞,挑取平板上的单克隆先进行双酶切鉴定,证明目的基因已经定向连入LV5载体。再对阳性克隆进行测序和序列比对,比对正确的即为构建成功的目的基因表达质粒载体,将构建好的慢病毒质粒载体进行超纯去内毒素抽提。与病毒包装辅助质粒共感染293T细胞,收集病毒上清液,通过超速离心法得到高滴度的慢病毒原液,慢病毒原液以MOI值为80感染骨髓间充质干细胞,进行慢病毒转染效果和目的基因表达检测。第二部分:分离培养2-3周雄性SD大鼠的骨髓间充质干细胞,P2-P3代转染包装好的慢病毒。120g左右的雄性SD大鼠70只,随机选取10只作为正常对照组,其余的60只SD大鼠饥饿,饮水自由24 h后,进行链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)按65mg/kg单次剂量腹腔注射,在STZ注射后的3、5和7d测定大鼠的空腹血糖,血糖≥13.3 mmol/L的大鼠用于糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DCM)大鼠模型,DM(Diabetes Mellitus)大鼠随机分为6组,每组10只,正常组、DM 组、DM+BMSCs 组、DM+BMSCs+Vehicle 组、DM+BMSCs+APN+组、DM+BMSCs+APN-组,通过尾静脉注射慢病毒转染的骨髓间充质干细后,每周检测各组大鼠体重、血糖指标,移植6周后,心肌组织行HE染色,免疫组化法检测心肌组织胶原Ⅰ和Ⅲ的表达水平。结果:(1)单克隆测序分析证实基因测序结果与APN序列一致,慢病毒感染骨髓间充质干细胞,荧光检测转染效率大于80%,Western Blot检测发现在27 KD附近处有目的蛋白特征条带;(2)DM大鼠模型具有明显的高血糖症状,心脏纤维化程度较重,心脏组织结构异常且心功能受损。APN修饰的BMSCs的输注可有效减轻DM大鼠的心肌损伤,减轻心脏纤维化程度,改善心脏结构。结论:APN修饰的BMSCs移植到DM大鼠后,可以显著缓解糖尿病大鼠的心肌损伤,改善心肌纤维化,从而改善糖尿病大鼠心脏功能。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.2;R542.2
【图文】：

浙江大学硕士学位论文逦第三章实验结果逡逑３．２慢病毒感染性滴度检测逡逑将慢病毒原液（１０－２０ｕｌ），用含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培液十倍稀释３－５个梯度逡逑转染２９３Ｔ细胞，转染２４邋ｈ吸弃病毒，正常培养７２邋ｈ后观察拍照，根据不同稀释逡逑梯度浓度的荧光图计算构建好的慢病毒滴度，如下图的荧光图片中所示，病毒的逡逑滴度＝荧光细胞数／病毒原液量（ＴＵ／ｍｌ），慢病毒滴度为ｌＸ１０８ＴＵ／ｍｌ。逡逑

４．邋ＢＭＳＣｓ的形态和慢病毒转染效果检测。（Ａ）为ＢＭＳＣｓ光镜照片，（Ｂ）为逡逑ＧＦＰ对照慢病毒的ＢＭＳＣｓ，Ｂ为转染过表徸ＡＰＮ病毒的ＢＭＳＣｓ，（Ｃ）为转逡逑ＦＰ对照慢病毒的ＢＭＳＣｓ邋，邋（Ｄ）为转染抑制ＡＰＮ表徸的慢病毒的ＢＭＳＣｓ，逡逑）为Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ检测ＡＰＮ的表达水平。逡逑４．邋Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ＢＭＳＣｓ邋ａｎｄ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ邋（Ａ）邋Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ逡逑ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃｕｌｔｕｒｅｄ邋ＢＭＳＣｓ邋（Ｌｉｇｈｔ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）．邋（Ｂ）邋ＧＦＰ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎ邋ＢＭＳＣｓ逡逑邋ａｆｔｅｒ邋ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｅｍｐｔｙ邋ｖｅｃｔｏｒ邋ｉｎｔｏ邋ＢＭＳＣｓ．邋（Ｃ）邋ＧＦＰ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎ邋ＢＭＳＣｓ邋４８逡逑ｔｅｒ邋ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＡＰＮ邋ｉｎｔｏ邋ＢＭＳＣｓ．邋（Ｄ）邋ＧＦＰ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎ邋ＢＭＳＣｓ邋４８邋ｈ邋ａｆｔｅｒ逡逑ｓｄｕｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＡＰＮ－ｓｈＲＮＡ邋ｉｎｔｏ邋ＢＭＳＣｓ．邋（Ｅ）Ｗｅｓｔｅｍ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＡＰＮ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑ｅｓｓｉｏｎ．逡逑２８逡逑

图６．各组大鼠心脏组织的ＨＥ染色。（Ａ）Ｃｏｎｔｒｏｌ组大鼠的心脏组织（４００倍）；（Ｂ）ＤＭ逡逑姐人鼠的心脏组织（４００倍）；（Ｃ）ＤＭ＋ＢＭＳＣｓ组大鼠的心脏组织（４００倍）；逡逑（Ｄ）ＤＭ＋ＢＭＳＣｓ＋Ｖｅｈｉｃｌｅ邋组大鼠的心脏组织（４００邋倍）；（Ｅ）邋ＤＭ＋ＢＭＳＣＳ＋ＡＰＮ＋组大逡逑鼠的心脏组织（４００倍）；（Ｆ）邋ＤＭ＋ＢＭＳＣｓ＋ＡＰＮ－组大鼠的心脏组织（４００倍）逡逑Ｆｉｇ邋６．邋Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ邋ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｓ邋ｏｆ邋ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｓｅｃｔｉｏｎｓ邋ｓｔａｉｎｅｄ邋ｗｉｔｈ逡逑Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ邋ａｎｄ邋Ｅｏｓｉｎ．邋（Ａ）邋ＨＥ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ｈｅａｒｔ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ邋ｒａｔｓ邋（４００逡逑Ｘ）；邋（Ｂ）邋ＨＥ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ｈｅａｒｔ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ＤＭ邋ｇｒｏｕｐ邋ｒａｔｓ邋（４００邋Ｘ）；邋（Ｃ）邋ＨＥ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ逡逑ｈｅａｒｔ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ＤＭ＋ＢＭＳＣｓ邋ｇｒｏｕｐ邋ｒａｔｓ邋（４００邋ｘ）；邋（Ｄ）邋ＨＥ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ｈｅａｒｔ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｉｎ邋ｔｈｅ逡逑ＤＭ＋ＢＭＳＣｓ＋Ｖｅｈｉｃｌｅ邋ｇｒｏｕｐ邋ｒａｔｓ邋（４０0ｘ）；邋（Ｅ）邋ＨＥ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ｈｅａｒｔ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｉｎ邋ｔｈｅ逡逑ＤＭ＋ＢＭＳＣｓ＋ＡＰＮ＋ｇｒｏｕｐ邋ｒａｔｓ邋（４０0ｘ）；邋（Ｆ）邋ＨＥ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ｈｅａｒｔ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｔｈｅ逡逑ＤＭ＋ＢＭＳＣｓ＋ＡＰＮ－ｇｒｏｕｐ邋ｒａｔｓ邋（４０0ｘ）．逡逑３．６邋ＡＰＮ修饰的ＢＭＳＣ

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本文编号：2792157