过表达钠-碳酸氢根离子共转运体通过促发细胞内钙超载加重小鼠心肌梗死后心脏重构

发布时间：2020-08-15 10:45

【摘要】：研究背景:钙离子从肌浆网释放到胞浆中来起动心肌细胞收缩,当钙离子由钙泵重吸收到肌浆网时,心肌细胞由收缩转为舒张。细胞内钙离子稳态对维持心肌收缩功能起重要作用。钙泵活性受多因素影响,如细胞内pH、钠离子浓度、钙离子浓度。在生理情况下,Na+/H+交换体(NHE)和Na+/HCO3-共转运体(NBC1)在调节细胞内pH、钠离子浓度、钙离子浓度中发挥重要作用。既往研究表明,抑制细胞膜上NHE可通过减少细胞内钠离子和钙离子蓄积而抑制缺血后心脏重构和改善心力衰竭。有研究表明在肥厚和衰竭的心脏中NBC1表达显著上调,提示心肌细胞排H+能力增强。随着H+从细胞中大量排出,钠离子大量进入细胞内引起钠离子超载,然后通过Na+/Ca2+交换体将钙离子移入细胞内,引起钙离子超载,而钠离子超载和钙离子超载可导致心功能失调。NBC1在肥厚和心衰的心脏中表达上调,但其具体作用机制暂不明确。因此,我们做出假设:心脏特异性过表达NBC1通过引起细胞内钙超载,降低心肌收缩力,促进心肌细胞凋亡,加重心脏重构。研究内容:1.本研究用NBC1转基因小鼠制作心梗模型,通过检测心功能、血流动力学、组织学等指标,验证NBC1过度激活对心脏重构的影响。2.在离体实验中,分离并培养成年小鼠心肌细胞,使用腺病毒过表达NBC1,在不同条件下检测心肌细胞钙离子动力学,阐明过表达NBC1引起细胞内钙超载,导致细胞收缩功能下降的机制。研究方法:研究方法分为在体研究方法(动物)和离体研究方法(成年小鼠心肌细胞)。1.在体研究方法:构建NBC1转基因(Tg)小鼠,在Tg和野生型(WT)小鼠上制作心梗模型,观察过表达NBC1对心梗后6周的心功能、血流动力学、心脏重构以及生存率的影响。2.离体研究方法:分离和培养C57BL/6成年小鼠心肌细胞(AMVMs)。构建NBC1过表达腺病毒,在AMVMs中过表达NBC1。处理因素为过表达NBC1、缺氧6小时、使用NBC1抑制剂S0859。检测不同条件下钙离子动力学及心肌细胞收缩功能、钙瞬变等指标。研究结果:1.Tg小鼠心梗后死亡率较WT组显著增加生存分析结果提示:心梗后6周,Tg组小鼠死亡率明显比WT小鼠高。NCB1转基因小鼠的死亡率为77.5%(31/40)明显高于野生型小鼠的死亡率30%(6/20)。小鼠死亡大多数发生在心肌梗死后的第3天至第10天。对死亡的小鼠进行尸体解剖发现肺水肿、胸腔积液、血凝块或心脏左室游离壁穿孔,这些结果提示心梗后死亡的主要原因是急性心力衰竭或心脏破裂。2.过表达NBC1恶化心肌梗死后6周的心功能在心梗6周的小鼠中,相对于假手术组,心梗组小鼠的左室舒张末内径(LVEDd)、左室收缩末内径(LVESd)、左室松弛时间常数(Tau)、心重体重比(HW/BW)及肺重体重比(LW//BW)明显增加;而左室舒张期前壁厚度(LVAWd)、左室缩短分数(LVFS)、左室射血分数(LVEF)、左室收缩压(LVSP)、左室压力最大上升速率(dp/dt max)、左室压力最大下降速率(dp/dt min)及收缩指数明显降低。心梗6周后相对于WT,Tg组小鼠dp/dt max、dp/dt min及收缩指数显著降低;而Tau明显升高;其他指标无明显差异。超声检查和左室血流动力学检查的结果表明,NBC1过表达加重心梗后6周左室功能障碍。3.过表达NBC1抑制AMVMs的收缩功能和恶化细胞钙离子动力学在AMVMs中,过表达NBC1加重缺氧对肌小节缩短率和钙瞬变振幅的抑制;过表达NBC1加重缺氧引起的钙瞬变达峰时间(Tpeak)和钙瞬变衰减时间常数(τd)的延长;给予NBC1抑制剂S0859后可以部分减轻过表达NBC1和缺氧对肌小节的缩短率,钙瞬变的振幅,Tpeak和Td的影响。4.过表达NBC1增加缺氧条件下AMVMs内钠离子和钙离子的浓度过表达NBC1或缺氧均增加AMVMs内钠离子和钙离子的浓度,过表达NBC1进一步加重缺氧诱导的细胞内钠离子和钙离子的浓度增加。使用NBC1特异性抑制剂S0859减轻缺氧和过表达NBC1引起的细胞内钠离子和钙离子的增加。5.过表达NBC1加重缺氧诱导的心肌细胞凋亡过表达NBC1明显增加了心梗后6周交界区心肌细胞的凋亡和缺氧诱导的AMVMs凋亡,而这一现象在AMVMs中可以被NBC1特异性抑制剂S0859部分拮抗。研究结论:过表达NBC 1通过促发心肌细胞内钙超载来加重小鼠心肌梗死后心脏重构。NBC1可能是治疗心脏重构的潜在靶点。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R542.22
【图文】：

转基因小鼠,心脏,基因型,博士学位论文

博士学位论文逡逑ＧＣＣＴＧＴＡＣＴＣＴＡＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣ－３＇逦，逦５ＣＴＡＣＡＡＧＴＧＣＣＡＡＧＡＴＣＡＴＴＡＣＴ－３，。使用杂合的邋ＮＢＣ１邋转基因小鼠（ｎ邋＝邋７它们的野生型（ＷＴ）同窝小鼠（ｎ邋＝邋７５）进行分析。获得了六对杂合子（），并且使用第７８对来繁殖后代，纯合子转基因小鼠和野生型小鼠用于后实验研宄。通过ＰＣＲ检测心脏特异性转基因ＮＢＣ１邋（图１Ｃ）。逡逑Ａ逡逑

心肌梗死,心脏,蛋白质表达,蛋白质印迹

小鼠心肌梗死后６周，分别通过实时定量ＰＣＲ和蛋白质印迹测定小鼠心脏逡逑中ＮＢＣ１的ｍＲＮＡ和蛋白质表达。结果显示：与假手术组相比，心肌梗死后６逡逑周小鼠心脏中ＮＢＣ１的ｍＲＮＡ和蛋白质表达都有明显的升高（图３－１，图３－２），逡逑提示ＮＢＣ１可能参与缺血性心脏疾病的发生和发展过程。逡逑木逡逑工勹逦邋《逡逑Ｑ逦■逡逑＾逦３．逦ｒｎｍｍ逡逑ａ逡逑＾邋？逡逑ｉ２－逦丁逡逑＾邋０－１邋￣￣—逡逑Ｓｈａｍ逦ＭＩ逡逑图３－１心肌梗死后６周，实时ｑＰＣＲ测定心脏中ＮＢＣ１的ｍＲＮＡ表达逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－１邋ｍＲＮＡ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃａｒｄｉａｃ邋ＮＢＣ１邋ｗａｓ邋ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ邋ｂｙ邋ｒｅａｌ邋ｔｉｍｅ邋ｑＰＣＲ邋ｉｎ邋ｔｈｅ逡逑ｍｉｃｅ邋６邋ｗｅｅｋｓ邋ａｆｔｅｒ邋ＭＩ逡逑２．0ｉ逦＊逡逑Ｓｈａｍ逦ＭＩ逦ｇ邋１．５－逡逑ＮＢＣｌ逦１２１ｋＤ邋＾邋１．０］逦？逡逑ＧＡＰＤｈ｜逦｜邋３７邋ｋＤ邋Ｚ逡逑—．．…－一—逦0．0Ｊ逦＾逦逡逑Ｓｈａｍ逦ＭＩ逡逑图３－２心肌梗死后６周，蛋白质印迹测定心脏ＮＢＣｌ的蛋白质表达。＞＜０．０５，心肌梗逡逑死组ｖｓ．假手术组。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－２邋Ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃａｒｄｉａｃ邋ＮＢＣ邋ｌ邋ｗａｓ邋ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ邋ｂｙ邋ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｍｉｃｅ邋６逡逑ｗｅｅｋｓ邋ａｆｔｅｒ邋ＭＩ．邋＊Ｐ邋＜邋０．０５，邋ＭＩ邋ｖｓ．Ｓｈａｍ．逡逑表３－ｌ．ＮＢＣｌ

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