【摘要】：目的:血管增生(vascular hyperplasia)是动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)、高血压、血管成形术后再狭窄等心血管疾病中普遍存在的病理生理表现。其主要特征表现为血管损伤后,位于血管中膜呈收缩表型的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)出现表型转化,转变为合成表型,增殖并迁移至内膜从而导致的一种血管重构现象。血小板源生长因子(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)由血管损伤部位的血小板、内皮细胞、VSMC和炎性细胞分泌产生,与其受体(PDGF receptor-b,PDGFR-β)结合后能够引起VSMC表型转化,进而发挥促细胞增殖和迁移的作用,对于血管重塑和内膜增生的发生发展具有明显的促进作用。内皮和平滑肌细胞来源的neuropilin样分子(endothelial and smooth muscle cell-derived neuropilin-like molecule,ESDN)是一类I型跨膜蛋白(type-I transmembrane protein),最初是在人类冠状动脉和高度转移性肺癌细胞中克隆得到的,其分子内含有一个CUB结构域和一个凝血因子V/VIII同源结构,与Neuropilins结构相似。课题组之前的研究表明,在培养的VSMC中,处于增殖状态时ESDN表达显著高于生长抑制的细胞,而ESDN的过度表达会抑制VSMC生长。在PDGF-BB诱导的VSMC增殖模型中,ESDN敲除及敲低能够上调PDGF-BB诱导的细胞增殖作用。该结果表明ESDN在调节血管细胞生长方面起着重要作用,其分子机制可能与ESDN对PDGF-BB及其受体的调控有关,但是,ESDN调控PDGF受体信号途径影响VSMC增殖和血管增生的机制研究目前尚不清楚。本实验利用小鼠颈总动脉结扎术诱导血管内膜增生模型以及PDGF-BB诱导VSMC增殖模型,探讨ESDN调控PDGF受体信号途径影响VSMC增殖及其与血管重构的关系。方法:1.平滑肌细胞特异性敲除小鼠的培育和基因型鉴定:利用从耶鲁大学医学院心血管系Dr.Mehran Sadeghi(Yale University School of Medicine)实验室引进Esdn~(flox/flox)小鼠和购买的SM22a-Cre小鼠培育平滑肌细胞特异性敲除小鼠。选取6~8周龄大小的小鼠,按雌雄比例为2:1进行交配,繁殖仔鼠,取仔鼠鼠耳组织提取基因组DNA,用聚合酶链反应(PCR)技术进行基因型鉴定,成功培育出Cre~(+/-)Esdn~(flox/flox)小鼠及其对照Cre~(-/-)Esdn~(flox/flox)小鼠,同时提取血管组织Western blot验证其敲除效果。2.小鼠内膜增生模型制备与分组选取8~12周的WT、Esdn~(-/-)小鼠,平滑肌细胞特异性敲除小鼠,雄性,各30只,随机分为3 d、7 d、14 d、21 d和假手术组,异氟烷吸入式麻醉,体式显微镜下行左侧颈总动脉结扎术,假手术组只分离血管,不结扎,分别于结扎术后3、7、14、21 d时生理盐水心脏灌流后取材。将取材的血管分为两部分,一部分用OCT包埋剂包埋、液氮迅速冷冻、冰冻切片,备用;另一部分用RIPA裂解液(50 mM Tris pH 7.5,150 mM NaCl,0.5%脱氧胆酸钠,1%NP-40,0.1%SDS,1 mM EDTA),临用前加入complete proteinase inhibitor(Roche Applied Sciences)和phosphatase inhibitor cocktails(Sigma-Aldrich)裂解,提取总蛋白质,Western blot检测VSMC增殖标志蛋白骨桥蛋白(osteopontin,OPN)以及分化标志基因α-骨骼肌肌动蛋白(smooth musclea-actin,SMa-actin)、平滑肌22a(smooth muscle22 alpha,SM22a)的表达。3.冰冻切片HE染色和免疫荧光染色分析选取结扎不同时间血管组织的冰冻切片(5mm),进行组织HE染色及免疫荧光染色,显微照相后利用Image J software(National Institutes of Health,USA)观察内膜增生和中膜变化确定其血管增生状态;利用荧光显微镜观察Esdn~(-/-)小鼠和野生型小鼠;平滑肌细胞特异性敲除小鼠Cre~(+/-)Esdn~(flox/flox)小鼠及其对照Cre~(-/-)Esdn~(flox/flox)小鼠各组不同时间点血管组织中ESDN、CD31(内皮细胞标志蛋白)和SMa-actin(VSMC标志蛋白)的阳性荧光强度。4.VSMC培养与siRNA敲低ESDN的表达按照本室报道的贴块法培养大鼠VSMC,取3-5代细胞进行实验。将VSMC接种在60mm小皿中,用含20%胎牛血清的无抗生素培养基,在37℃和5%CO_2细胞培养箱中孵育12-24小时后,待细胞生长至60-70%融合时,细胞用20 nM的ESDN siRNA或通用阴性对照(锐博)小干扰RNA转染,按照Lipofectamine RNAi Max试剂盒操作说明进行。转染24小时之后根据细胞密度换液,继续培养24 h后,换成无血清培养基血清饥饿24 h后,分别给予PDGF-BB(10 ng/mL)刺激不同时间(0、5、15、30 min),收集RNA确定转染效率和蛋白用于Western blot检测PDGF信号途径的变化。5.细胞膜蛋白和胞浆蛋白的提取培养的VSMCs,利用siRNA敲低ESDN表达,血清饥饿24 h后,应用PDGF刺激不同时间后,利用Invent公司Minute-~(TM)总膜和质膜提取试剂盒分别提取胞浆和胞膜蛋白,Western blot检测PDGFR-β在敲低ESDN表达后在细胞各组分中分布的不同。6.细胞表面PDGFR-β的测定为观察ESDN表达对VSMC表面PDGFR-β动态变化的影响,培养的大鼠VSMC应用siRNA敲低ESDN的表达后,在PDGF刺激不同时间(0、5、30 min)的培养基中加入生物素(0.15 mg/mL sulfo-NHS-SS-biotin,Pierce,Rockford,IL)对细胞表面蛋白进行共价标记,10 min后应用1×PBS缓冲液(137 mM NaCl,2.7 mM KCl,2 mM KH_2PO_4,10 mM Na_2HPO_4)清洗并终止反应,加入细胞裂解液(50 mM Tris pH 7.5,150 mM NaCl,0.5%脱氧胆酸钠,1%NP-40,0.1%SDS,1mM EDTA),临用前加入complete proteinase inhibitor(Roche Applied Sciences)和phosphatase inhibitor cocktails(Sigma-Aldrich),离心收集上清用于细胞总PDGFR-β的测定;应用链合亲霉素(Streptavidin-agarose beads,Upstate Biotechnology,Lake Placid,NY)收集生物素标记的蛋白,清洗后上样Western blot检测细胞表面PDGFR-β的变化。结果:1.平滑肌细胞特异性Esdn敲除小鼠基因型鉴定对Esdn~(-/-)小鼠;平滑肌细胞特异性敲除小鼠Cre~(+/-)Esdn~(flox/flox)小鼠及其对照Cre~(-/-)Esdn~(flox/flox)小鼠进行基因型鉴定。Esdn~(-/-)小鼠基因型鉴定引物(PCR扩增产物长度为360 bp):上游引物:5’-CAGCCAAACCTCCAGAAAAG-3’下游引物:5’-AAGCTTAAGTGATGTGACAG-3’Esdn~(flox/flox)小鼠基因型鉴定引物(280bp,野生型为230 bp)上游引物:5’-CAGCCAAACCTCCAGAAAAG-3’下游引物:5’-TCACAAGAGAGAGGGGTGCT-3’SM22 Cre小鼠基因型鉴定引物(阳性对照324 bp,Cre 100 bp)SM22-Cre上游引物:5’-GCGGTCTGGCAGTAAAAACTATC-3’SM22-Cre下游引物:5’-GTGAAACAGCATTGCTGTCACTT-3’SM22-Cre阳性对照上游引物:5’-CTAGGCCACAGAATTGAAAGATCT-3’SM22-Cre阳性对照下游引物:5’-TAGGTGGAAATTCTAGCATCATC-3’琼脂糖凝胶电泳结果显示在目的区域呈现清晰的条带,表明基因型鉴定正确,平滑肌细胞特异性Esdn基因敲除小鼠构建成功。提取不同基因型小鼠血管组织进行Western blot检测ESDN的表达,在Esdn~(-/-)小鼠血管组织中未检测到ESDN的表达,而在平滑肌细胞特异性基因敲除小鼠血管组织中ESDN的表达较对照小鼠显著下降,结果进一步证实了基因型鉴定正确,表明平滑肌细胞特异性基因敲除小鼠构建成功。2.ESDN缺失促进内膜损伤后的血管增生WT、Esdn~(-/-)小鼠结扎不同时间后取材,HE染色结果显示,随着结扎时间的延长,与对照组相比,Esdn~(-/-)小鼠血管中膜VSMC排列紊乱,内膜逐渐增厚,管腔狭窄,在结扎21 d时达到高峰。随后Western Blot检测平滑肌增殖标志蛋白OPN,平滑肌分化标志蛋白SMa-actin、SM22a的表达情况,结果显示,与对照组相比,随着结扎时间的延长,Esdn~(-/-)小鼠血管组织中OPN的表达均逐渐增加,结扎21 d时达到高峰;SMa-actin、SM22a的表达均逐渐降低,结扎21 d时达到最低。应用免疫荧光染色技术进一步观察ESDN表达对血管中膜SMC增生的影响,结果显示,在结扎21 d时,ESDN的表达与血管组织中SMC标志物SMa-actin的表达呈现共定位现象,表明ESDN可能通过影响中膜SMC的增殖进而影响血管增生过程。这一结果在平滑肌细胞特异性敲除小鼠得到了进一步的验证。3.ESDN表达下调促进PDGF的信号途径为进一步探讨ESDN缺失促进血管增生的分子机制,体外培养大鼠VSMC,siRNA敲低ESDN的表达,血清饥饿后,用10 ng/mL的PDGF-BB处理VSMC不同时间后收集蛋白,Western blot检测PDGF受体磷酸化及其下游信号途径的变化。结果显示,与对照组相比,ESDN表达下调促进PDGF诱导的PDGFR-β的磷酸化活化,在PDGF刺激15 min达到峰值。同时对与VSMC迁移和增殖相关的PDGF下游信号分子进行了检测,Western blot结果显示,与对照组相比,ESDN表达下调促进PDGF诱导的MAPK-ERK和Akt的磷酸化活化,在PDGF刺激后的5 min和15 min各自达到其峰值。这一结果表明,ESDN表达下调可能通过促进PDGF诱导的PDGFR-β的磷酸化活化,进而激活下游相关信号分子MAPK-ERK和Akt的磷酸化,加速VSMC的迁移和增殖过程,与整体动物实验得到的结果一致。4.ESDN敲低加速PDGF诱导的PDGFR-β胞吞过程研究表明,PDGF与其相应的受体PDGFR-β结合后引起受体磷酸化活化并经过胞吞作用进入细胞质基质,为确定ESDN表达是否能够调控PDGF诱导的PDGFR-β胞吞过程,应用生物素标记细胞表面蛋白并用Streptavidin富集并Western blot检测细胞膜上PDGFR-β的分布,结果表明ESDN敲低后细胞表面的PDGFR-β较对照组显著减少,表明ESDN表达下调促进PDGF诱导的PDGFR-β胞吞过程;同时提取了膜蛋白、胞浆蛋白检测了PDGFR-β在细胞不同组分的分布,结果表明与对照组相比,ESDN敲低显著减少了PDGF刺激后PDGFR-β在细胞膜的分布,而在同一时间点PDGFR-β在细胞胞浆的分布显著高于对照组。这些结果表明,ESDN表达下调促进PDGF的信号途径可能是通过增强PDGFR-β胞吞过程相关。结论:1.ESDN缺失小鼠和平滑肌细胞ESDN特异性敲除小鼠血管中膜平滑肌细胞增殖和新生内膜增生增强;2.ESDN表达下调促进血管平滑肌细胞PDGF信号途径;3.ESDN调控PDGF的信号途径的分子机制与其对PDGFR-β胞吞过程的调控有关。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R54
【图文】：
图 1 小鼠子代基因型鉴定和不同品系小鼠血管组织 ESDN 的表达Fig.1 The identification of the offspring genotypes and ESDN expressionlevels in aortaA：PCR results . 1: WT, 2: Esdn-/-mice, 3: Esdnflox/+mice, 4: Esdnflox/floxmice,5: Cre-/-Esdnflox/floxmice, 6: Cre+/-Esdnflox/floxmice. B: Western blottinganalysis of ESDN expression in aorta from different mice.
29图 2 野生型和 Esdn-/-小鼠结扎后不同时间点血管增生的变化Fig.2 The vascular hyperplasia in isolated aorta from WT and Esdn-/-mice at different time point after ligationA: HE staining of representative cross-sections of the carotid artery inwild and Esdn-/-mice at different times of ligation. Bar: 200 m. B:Immunofluorescence staining of -actin in ligated carotid arteries ofdifferent ages. Bar: 50 m.
30图 3 野生型和 Esdn-/-小鼠结扎后不同时间点血管组织中平滑肌细胞表型相关蛋白表达的变化Fig.3 The marker genes of phenotypic switch expression in isolated aorta fromWT and Esdn-/-mice at different time point after ligationCompared with the WT group, the expression of SM -actin and SM22was decreased, while OPN expression was increased in Esdn-/-aorta atdifferent time points after ligation. n=3, *P<0.05 compare with control groupat the same time point.
【相似文献】
相关期刊论文 前10条
1 武士华;;血管增生抑制因子与抗肿瘤作用[J];国外医学.药学分册;1993年06期
2 李培进;美科学家分离和纯化了促血管增生的蛋白质[J];解放军医学杂志;1986年02期
3 李贵军,王廷基,辛建军,关维民;肾血管增生致血尿6年1例[J];临床泌尿外科杂志;2000年01期
4 孙海燕,刘舒;抑制血管增生可能是动脉粥样硬化新的治疗策略[J];中国动脉硬化杂志;2005年01期
5 宝福凯;癌基因H-ras刺激肿瘤血管增生的机制[J];生理科学进展;1998年01期
6 肖林生,修瑞娟;微血管增生及转基因治疗缺血性疾病[J];中国微循环;1999年03期
7 周世恒;;喉骨化软骨之血管增生与癌肿扩散[J];国外医学参考资料.耳鼻咽喉科学分册;1979年02期
8 蔡亚华;蔡红端;江如苹;;1例下颌骨中心性血管瘤急性出血患者的门诊急救与护理[J];吉林医学;2011年34期
9 陈淑霞;血管增生与慢性髓细胞性白血病治疗效果的关系[J];中国血液流变学杂志;2003年04期
10 高俊茶;高丽君;吕晓萍;;血管增生与肝纤维化研究进展[J];中国老年学杂志;2015年02期
相关会议论文 前5条
1 肖林生;修瑞娟;;微血管增生及转基因治疗缺血性疾病[A];科技进步与学科发展——“科学技术面向新世纪”学术年会论文集[C];1998年
2 孔繁圣;;针对VEGFR—2的眼底血管增生基因疗法[A];中华医学会第十二届全国眼科学术大会论文汇编[C];2007年
3 祁少海;沈锐;谢举临;刘坡;徐盈斌;利天增;;以血管内皮细胞生长因子受体为靶点抑制瘢痕血管增生的研究[A];第八届全国烧伤外科学年会论文汇编[C];2007年
4 邢世会;曾进胜;凌莉;候清华;李晶晶;张玉生;李踔;;EphB2-Fc促进了脑梗死后侧脑室下区、同侧纹状体和梗死灶周血管增生[A];第十一届全国神经病学学术会议论文汇编[C];2008年
5 毕建忠;;转基因鼠模型中诱导血管增生对记忆的改善作用山东大学第二医院神经内科[A];山东省第三次中西医结合神经内科学术研讨会论文汇编[C];2011年
相关重要报纸文章 前3条
1 印高乐;羊膜可抑制血管增生[N];医药经济报;2002年
2 印高乐;台湾医生发现羊膜具有抑制血管增生功能[N];中国高新技术产业导报;2002年
3 王雨生邋张中桥;脉络膜血管增生疗法比较[N];健康报;2007年
相关博士学位论文 前3条
1 赵一清;脑膜瘤瘤周硬膜血管增生的影响因素以及其在凸面脑膜瘤切除中的作用[D];华中科技大学;2014年
2 孙笑;血管增生促进缺血损伤脑内神经血管单元重构的细胞机制研究[D];复旦大学;2013年
3 刘熙秋;纳米载体输送核酸药物分子用于癌症治疗的研究[D];中国科学技术大学;2012年
相关硕士学位论文 前7条
1 孟泽琪;跨膜蛋白ESDN通过对PDGF受体信号途径的调控影响血管平滑肌细胞增殖和血管增生[D];河北医科大学;2018年
2 安晓;膝骨性关节炎中的血管增生研究[D];中国人民解放军医学院;2015年
3 田素建;肾细胞癌血管增生与肝素酶、环氧化酶-2的关系[D];山东大学;2011年
4 沈锦城;用Canstatin-N抑制大鼠视网膜血管增生的研究[D];海南大学;2012年
5 徐丽华;半胱氨酰白三烯及其受体对血管增生的作用[D];浙江大学;2010年
6 陈祥;烟雾病患者外周血中细胞因子及调节性T细胞水平的相关研究[D];南京大学;2015年
7 黄河;基于视网膜图像的血管增生自动检测方法研究[D];东北大学;2013年
本文编号：
2798302
